L'immunofluorescenza è un metodo di base che può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo surrenale sulla zonazione surrenale, l'identità cellulare e la funzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio di più proteine preservando la morfologia del tessuto surrenale. Per rimuovere la ghiandola surrenale murina, tagliare intorno al tessuto adiposo circostante e posizionare la ghiandola in un pozzo di una piastra a 24 polilitri contenente PBS fresco sul ghiaccio.
Trasferire la ghiandola su una piastra di Petri o un supporto di vetro al microscopio sezionato e utilizzare due aghi calibro 25 per rimuovere il tessuto adiposo adiacente. Quando tutto il grasso è stato rimosso, fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore. Alla fine dell'incubazione, sciacquare la ghiandola con tre lavaggi di 15 minuti a quattro gradi Celsius in uno o due millilitri di PBS fresco per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare la ghiandola in due immersioni sequenziali di etanolo a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore per incubazione. Per preparare il tessuto surrenale per la lavorazione, avvolgere la ghiandola in garza e racchiudere la surrenalica in una cassetta che incorpora tessuti. Quindi, posizionare la cassetta in un barattolo riempito con 70%etanolo per uno stoccaggio di quattro gradi Celsius fino alla lavorazione.
Per elaborare il tessuto, inserire la cassetta nel processore tissutale per la lavorazione come indicato nella tabella. Alla fine del programma, trasferire la cassetta in una stazione di incorporamento piena di paraffina 65 gradi fusa e utilizzare un paio di forcep per scartare la garza. Trasferire delicatamente la surrenalica nella posizione appropriata al centro della base dello stampo di incorporamento e versare la paraffina fusa sulla ghiandola.
Quindi, spostare attentamente lo stampo di incorporamento su un vassoio di raffreddamento per facilitare l'indurimento della paraffina. Prima di sessare con microtomo rotante, etichettare una serie di vetrini al microscopio e posare le diapositive su uno scaldascivolo Celsius di 37 gradi. Distribuire circa 450 microlitri di acqua ultra pura di tipo autoclavato su ogni scivolo e impostare lo spessore di taglio della sezione del microtomo su cinque micrometri.
Caricare il tessuto incorporato sul blocco di taglio e abbassare il blocco di paraffina fino a quando il campione non è a livello del viso con il bordo della lama del microtomo. Ruotando il volantino con un ritmo costante, eseguire un taglio iniziale per rimuovere la paraffina ed esporre il tessuto surrenale. Quindi, acquisire cinque sezioni di micrometro attraverso l'estremità della ghiandola surrenale usando le forcep per trasferire ogni sezione nella goccia d'acqua su uno dei vetri pre-etichettati man mano che viene raccolta.
Dopo aver confermato la presenza di tessuto nelle sezioni per microscopia, asciugare gli scivoli sulla piastra calda per circa due ore e cuocerli almeno durante la notte su una slide tray a 37 gradi Celsius fino a quando non è visibile più acqua. Una volta asciutti, conservare le diapositive in una slide box a temperatura ambiente. Per il recupero dell'antigene ad immunofluorescenza, de-paraffinare le diapositive con due immersioni di cinque minuti al 100% di xilene, seguite da reidratazione in una serie di immersione in etanolo e acqua discendente.
Dopo l'immersione in acqua, trasferire gli scivoli su un supporto per vetrini metallici e posizionare il supporto in un bicchiere di citrato molare bollente 0,01 su una piastra calda per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il becher dalla piastra calda e lasciarlo raffreddare per 20 minuti, facendo attenzione che tutte le sezioni surrenali siano ancora coperte di tampone. Quando il becher viene raffreddato, trasferire gli scivoli in un barattolo coplin per tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco con un leggero dondolo.
Dopo l'ultimo lavaggio, pulire con cura la superficie di ogni diapositiva senza danneggiare le sezioni tissutali e utilizzare un marcatore idrofobico per creare un cerchio intorno a ogni sezione. Posizionare i vetrini in una camera umidificata e aggiungere rapidamente almeno 50 microlitri di soluzione di blocco ad ogni sezione per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, lavare gli scivoli tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio con dondolo e restituire gli scivoli alla camera.
Successivamente, aggiungere il cocktail di anticorpi primari di interesse a ogni sezione per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti in PBS fresco per lavaggio ed etichettare i vetrini con l'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'ora protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti su un rocker protetto dalla luce, etichettando i nuclei delle sezioni con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce dopo l'ultimo lavaggio.
Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti con dondolo, aggiungere 60 microlitri di agente di montaggio adatti all'immunofluorescenza lungo la superficie di un vetro di copertura per campione e premere leggermente ogni sezione del tessuto di scorrimento sul vetro di copertura, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi, posare ogni scivolo piatto in un contenitore scuro per la polimerizzazione a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima dell'imaging. Durante il processo di rimozione del grasso, è fondamentale non lasciare asciugare la ghiandola surrenale poiché la disidratazione può danneggiare la struttura del tessuto.
A seguito di una rimozione riuscita del tessuto adiposo circostante, la ghiandola surrenale dovrebbe essere facilmente rilevabile senza grasso visibile aggiuntivo. L'immunosottenzione delle sezioni di ghiandola surrenale come dimostrato rivela il fattore steroidogenico nucleare una colorazione delle cellule adrenocorticali, la colorazione dell'idrossilasi tirosina delle cellule midollari, la colorazione DAPI dei nuclei delle cellule non steroidogeniche della capsula esterna e la co-colorazione con cellule adrenocorticali e midollari. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che le surrenali del mouse sono piccole e che le loro posizioni sono in qualche modo variabili rendendo difficile il loro rilevamento.
Pertanto, è fondamentale avere una visione chiara dell'area durante la dissezione. Queste procedure sono tecniche di base per lo studio della ghiandola surrenale in vivo. A seguito di questi, è possibile eseguire ulteriori metodi di immunosocienza per soddisfare specifiche esigenze scientifiche.
Dopo il suo sviluppo, l'immunostaining ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della scienza biomedica per esplorare l'espressione proteica in situ, uno strumento utile in molte discipline e campi.
