Ciao, mi chiamo Bartolomeo Bosco e sono dottorando presso il Laboratorio di Rete Trascrizionale presso il Centro di Biologia Integrativa dell'Università di Trento in Italia. Come sapete, la trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione spaziale e temporale del fattore di trascrizione e del cofattore. La maggior parte di essi, incluso il P53 umano, riconosce specifici elementi che agiscono dal CIS, chiamati elementi di risposta, e il legame su questo sequenziamento del DNA è necessario per la modulazione della trascrizione dei geni bersaglio.
In questo lavoro, vorremmo mostrarvi il protocollo per studiare la sequenza P53 specifica nelle funzioni di transattivazione utilizzando il lievito come sistema modello come proteina in un gene color reporter o luciferasi o sulla quantificazione della crescita cellulare per evidenziare i principali passaggi sperimentali e la versatilità di questi approcci. Primo protocollo, costruzione di ceppi di lievito reporter che contengono uno specifico elemento di risposta P53 a monte dell'adenina-2 o del gene della luciferasi della lucciola. Per costruire un ceppo reporter, seguire prima i passaggi da 1.1 a 1.15 per trasformare le cellule di lievito con oligonucleotidi rivolte alla regione promotrice desiderata.
La trasformazione si basa sul protocollo standard basato sull'acetato di litio. Una volta che i trasformatori appaiono su piastre 5-FOA, di solito dopo tre giorni di incubazione a 30 gradi, replicarli su piastre YPDA non selettive e anche su piastre YPDA contenenti G418, contrassegnando ogni piastra per facilitarne il successivo confronto. Incubare le piastre durante la notte a 30 gradi.
Il giorno dopo, identifica i candidati reporter provenienti da colonie sensibili al G418 ma cresciute sulle tavole dell'YPDA. Striati le colonie identificate su una nuova piastra YPDA per ottenere isolati di singola colonia e lasciarli crescere per due giorni a 30 gradi. Controllare la corretta integrazione dell'elemento di risposta P53 desiderato, eseguendo una reazione PCR con le condizioni menzionate nel passaggio 1.20.
Caricare un'aliquota del prodotto PCR sul gel di agarosio per controllare la lunghezza corretta dell'amplicon prima del sequenziamento di Sanger. Secondo protocollo, presentiamo un esempio di come valutare la capacità di trasattivazione delle proteine P53 utilizzando il saggio qualitativo del lievito di adenina-2 a base di colore. Trasforma le cellule di lievito con vettori di espressione P53 seguendo lo stesso protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione uno.
Striare colonie di trasformatori di lievito singolo, fino a sei per piastra, su una nuova piastra selettiva, e lasciarle crescere durante la notte a 30 gradi. Il giorno dopo, utilizzando velluti sterili, replicare le striature su nuove piastre selettive che consentono la valutazione del fenotipo di colore, cioè piastre selettive contenenti quantità limitante di adenina.
Incubare a 30 gradi per tre giorni. Le stesse striature possono essere replicate più volte. Terzo protocollo, presentiamo ora un esempio della valutazione della capacità di trasattivazione delle proteine P53 utilizzando il saggio quantitativo di lievito LUC1 a base di luminescenza.
In primo luogo, trasformare le cellule di lievito con vettori di espressione P53 seguendo, ancora una volta, il protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione due. Patch singoli trasformatori su nuove piastre selettive contenenti glucosio come fonte di carbonio, e lasciarli crescere a 30 gradi durante la notte. Per ogni tipo di trasformazione, creare da cinque a sette patch diverse.
Dopo la crescita notturna, rimpisodere una piccola quantità di cellule usando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta in mezzo selettivo sintetico contenente raffinosa come fonte di carbonio. Queste sospensioni cellulari dovrebbero avere una densità ottica a 600 nanometri intorno a 0,4 e possono quindi essere divise in più piastre da 96 pozzi per l'incubazione a diverse temperature, trattamenti o per esporre le cellule a una quantità variabile di galattosio per attivare l'espressione P53. Per misurare l'attività del reporter lucciola, trasferire da 10 a 20 microlitri di sospensione cellulare dalla piastra trasparente da 96 po 'in una piastra bianca da 384 po 'e mescolare le cellule con un volume uguale di tampone di lisi, incubando per 10, 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker.
Aggiungere 10, 20 microlitri di substrato di luciferasi lucciola. E misurare le unità luminose utilizzando un lettore di lastre multietichetta. Misurare anche la densità ottica delle colture nella piastra a 96 pozzi.
Quarto protocollo, presentiamo ora un esempio di come sfruttare l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53. Trasforma le cellule di lievito con vettori di espressione P53 o cotrasformali con vettori di espressione per coesprimere P53 e uno dei suoi cofattori, come MDM2, seguendo, ancora una volta, il protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione uno. Far crescere le cellule trasformanti in mezzo selettivo a circa una densità ottica.
E diluirli a 0,05, e aggiungere una molecola scelta alla concentrazione appropriata. Incubare le cellule a 30 gradi su uno shaker per 42 ore. Quindi, seminare 100 microlitri di coltura cellulare di lievito in piastre medie selettive minime.
Incubare per due giorni a 30 gradi. La corretta integrazione RE al posto della cassetta ICORE può essere controllata dalla PCR colonia, a partire da una piccola quantità di cellule dai cloni di lievito candidati e utilizzando primer descritti nella tabella tre per amplificare il locus mirato. I prodotti PCR, una banda di circa 500 nucleotidi, possono quindi essere controllati sequenziando Sanger per confermare la sequenza della posizione genomica modificata per la presenza della corretta sequenza di elementi di risposta P53.
Il ceppo reporter è pronto per essere utilizzato in saggi funzionali. Per valutare la capacità di traslattivazione delle proteine P53, controllare il colore delle colonie di lievito. Ad esempio, presentiamo un confronto tra P53 di tipo selvaggio e i mutanti R175H e R282W utilizzando due diversi reporter, P21-5-prime e PUMA, e due temperature diverse, 30 gradi e 37 gradi.
È interessante notare che, mentre R175H è un allele P53 a perdita di funzione, colonie rosse in tutte le condizioni, R282W mostra sensibilità alla temperatura con attività di transattivazione residua a 30 gradi, con conseguente colonie bianche, ma perdita di attività a 37 gradi, con conseguente colonie rosse o rosa. Un set di dati esteso è presentato nella figura due B.Wild tipo P53 in quattro alleli mutanti sono stati testati per la trasattivazione utilizzando 10 diversi ceppi di reporter di elementi di risposta P53, tre temperature e livelli di espressione costitutiva. I risultati sono riassunti in un codice colore che ricorda il fenotipo di colore della colonia di lieviti.
L'allele mutante P53 K139E mantiene un'attività parziale ed è sensibile al freddo. Ad esempio, le colonie sono rosse nel ceppo reporter GADD45 a 24 e 30 gradi, ma sono bianche a 37 gradi. Qui presentiamo un esempio di risultati ottenuti con questo metodo, confrontando la specificità di transattivazione del lievito P53 umano e C.elegans.
I risultati nel grafico a barre sono espressi come unità di luce relative medie con errore standard di quattro repliche. Sono stati confrontati cinque diversi elementi di risposta P53. Tre diversi livelli di espressione proteica P53 sono stati testati variando la concentrazione di galattosio nel mezzo.
I due ortologi P53 mostrano una specificità di trasattivazione marcatamente diversa. Ciò è esemplificato dai risultati con elementi di risposta ced13 e V1 che condividono la stessa sequenza, ad eccezione della presenza o dell'assenza di un distanziale a 28 nucleotidi. Human P53 mostra una trasattivazione molto più elevata con il sito di legame V1, mentre C.elegans P53 mostra il contrario.
I risultati sono indipendenti dal livello di espressione P53 sotto il promotore inducibile al galattosio. Misurare la crescita del lievito contando il numero di colonie ottenute nelle gocce di coltura dei 100 microlitri. Calcola l'effetto di riattivazione mutante dei composti considerando la crescita del lievito di tipo selvatico P53 che esprime il lievito come il massimo effetto possibile, impostato al 100%, mentre la crescita delle cellule che esprimono il mutante P53 rappresenta un livello zero di riattivazione.
In questo esempio, Nutlin-3a allevia l'inibizione del P53 di tipo selvatico causata dalla coespressione di MDM2, mentre PhiKan083 riattiva parzialmente il mutante Y220C P53. In entrambi i casi, ciò si traduce in una riduzione dipendente dal P53 della crescita del lievito. Le cellule basali del lievito si sono dimostrate utili per indagare i valori, gli aspetti delle funzioni proteiche P53.
Il protocollo descritto in questo lavoro è particolarmente sensibile per valutare il potenziale di trasattivazione del P53 mutante di tipo selvatico o associato al cancro a varianti di siti bersaglio. Inoltre, l'approccio può essere utilizzato per identificare piccole molecole che influenzano le funzioni P53 e per studiare l'interazione P53 con il cofattore. L'uso dei giornalisti di colore, la miniaturizzazione della luciferasi, così come il test di inibizione della crescita si traducono in test convenienti e scalabili potenzialmente suscettibili allo screening della biblioteca chimica.
Infine, il sistema descritto in questo lavoro può essere facilmente adottato con lo studio di altri fattori di trascrizione specifici della sequenza.
