L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire indicazioni dettagliate per utilizzare il minigene E1A2 per valutare le modifiche globali allo splicing dell'mRNA. Questo è uno strumento rapido, economico e semplice per valutare la funzione della proteina bersaglio nella regolazione dello splicing alternativo senza la necessità di regimi speciali o condizioni di laboratorio. Inizia coltivando cellule HEK 293 con espressione stabile del gene di interesse.
Dividere le cellule utilizzando lo 0,25% di tripside EDTA, quindi placcare 300.000 cellule per pozzo in piastre a sei pozzi e incubarle per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Dopo 24 ore, controllare la confluenza e trasfetto le celle stabili HEK 293 solo quando il 70-80% è confluente. Rimuovere con cura il mezzo di coltura cellulare con una pipetta, quindi aggiungere due millilitri di mezzo DMEM completo senza antibiotici e rimettere la piastra nell'incubatrice.
Preparare un tubo con il tampone di trasfezione, quindi aggiungere due microgrammi di DNA, vortice e aggiungere due microlitri di reagente di trasfezione. Vortice di nuovo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e aggiungere con cura la miscela di trasfezione per quanto riguarda la goccia.
Sei ore dopo la trasfezione, aggiungere la tetraciclina alle celle stabili HEK 293 per l'induzione dell'espressione Nek4. 24 ore dopo la trasfezione, verificare la morfologia cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio fluorescente. Utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo di coltura cellulare, quindi aggiungere il mezzo di coltura cellulare con la chemioterapica.
Incubare le cellule per altre 24 ore. Per raccogliere l'RNA, scartare il mezzo di coltura cellulare e aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di reagente di estrazione dell'RNA direttamente al pozzo. Se i pozzi sono molto confluenti, utilizzare un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA per migliorare la qualità dell'RNA.
Omogeneizzare le cellule con una pipetta e trasferirle in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA o conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Scongelare i campioni in una cappa aspirante e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere da 0,1 a 0,2 millilitri di cloroformio e agitare vigorosamente, quindi incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 15 minuti a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius, quindi raccogliere la fase acquosa superiore e trasferirla in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Raccogliere circa il 60% del volume totale, ma non raccogliere il DNA o la fase organica.
Aggiungere da 0,25 a 0,5 millilitri di isopropanolo e agitare il campione per inversione quattro volte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Lavare il pellet di RNA due volte con etanolo e centrifugare a 7.500 volte G per cinque minuti, quindi scartare l'etanolo.
Rimuovere l'etanolo in eccesso invertendo il tubo su un tovagliolo di carta, quindi lasciare il tubo aperto all'interno di una cappa aspirante per asciugare parzialmente il pellet per cinque-10 minuti. Sospendere di nuovo il pellet di RNA in 15 microlitri di acqua trattata con DEPC. Quantificare l'RNA totale e verificare la qualità dell'RNA misurando l'assorbanza a 230, 260 e 280 nanometri.
Per verificare la qualità totale dell'RNA, eseguire un gel di agarosio dell'1% pretrattato con l'1,2% di una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5% per 30 minuti. Eseguire la sintesi di cDNA utilizzando da uno a due microgrammi di RNA totale. Unire l'RNA, un microlitro di oligo d-T, un microlitro di DNTP e acqua priva di nucleasi a 12 microlitri.
Incubare la reazione nel Termociclometro per cinque minuti a 65 gradi Celsius. Rimuovere i campioni dal Thermo Cycler e aggiungere quattro microlitri di tampone di trascrittasi inversa, due microlitri di DTT e un microliter di inibitore della ribonucleasi. Incubare a 37 gradi Celsius per due minuti.
Aggiungere un microlitro di trascrittasi inversa termo stabile e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Inattivare l'enzima a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Eseguire la PCR come descritto nel manoscritto di testo, quindi caricare da 20 a 25 microlitri del prodotto PCR su un gel di agarosio al 3% contenente macchia di acido nucleico e correre a 100 volt per circa un'ora.
Fotografa il gel, evitando qualsiasi saturazione della banda e quantifica le bande utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Le bande a 631, 493 e 156 coppie di basi corrispondono rispettivamente alle isoforme 13S, 12S e 9S. Dal menu File del software aprire il file di immagine e convertirlo in scala di grigi.
Regolare luminosità e contrasto, quindi rimuovere il rumore outlier, se necessario. Disegnare un rettangolo intorno alla prima corsia con lo strumento di selezione del rettangolo e selezionarlo tramite il comando Analizza, Gel e Seleziona prima corsia oppure utilizzando la scelta rapida da tastiera. Usare il mouse per fare clic e tenere premuto nel mezzo del rettangolo sulla prima corsia e trascinarlo sulla corsia successiva.
Passare ad Analizza, Gel e Selezionare Corsia successiva. Ripetere questo passaggio per tutte le corsie rimanenti. Dopo che tutte le corsie sono evidenziate e numerate, vai ad Analyze, Gels e Plot Lanes per disegnare un grafico di profilo di ogni corsia.
Utilizzare lo strumento di selezione della linea retta per disegnare una linea attraverso la base di ogni picco, corrispondente a ciascuna banda, tralascio il rumore di fondo. Dopo che tutte le cime di ogni corsia sono state chiuse, selezionare lo strumento bacchetta e fare clic all'interno di ogni picco. Le misurazioni devono apparire nella finestra dei risultati per ogni picco evidenziato.
Si consideri solo i picchi 13S, 12S e 9S corrispondenti a 631, 493 e 156 bande di coppie di basi. Copiare i dati sull'intensità per un editor di fogli di calcolo e sommare l'intensità di tutte e tre le bande per ogni campione, quindi calcolare la percentuale per ogni isoforma relativa al totale. Tracciare le percentuali di ogni isoforma o le differenze nella percentuale rispetto ai campioni non trattati.
Un plasmide contenente il minigene di E1A è stato utilizzato per osservare l'effetto sullo splicing alternativo valutando la proporzione di mRNA di ogni isoforma prodotta. L'espressione basale delle varianti di isoforme E1A dipendeva dalla linea cellulare e dal tempo dell'espressione E1A. La linea cellulare stabile HEK 293, o sito contenente ricombinazione HEK 293, mostrava un'espressione più alta di 13S rispetto alle cellule HeLa, ma mostrava livelli simili di isoforme 13S e 12S dopo 48 ore di espressione E1A.
Le cellule esposte al cisplatino mostravano uno spostamento in cinque prime selezioni di splicing S-S favorendo l'espressione 12S. Questo effetto è stato osservato in HEK 293 che esprime stabilmente il vettore vuoto flag, così come l'isoforma di Nek4. I cambiamenti nello splicing alternativo dopo il trattamento paclitaxel erano molto discreti, ma le direzioni dei cambiamenti erano opposte nelle cellule che esprimevano Flag e Nek4.
Quando si esegue questo protocollo, è importante utilizzare controlli transcriptasi non traslattati e non inversi per evitare interpretazioni errate con espressione E1A endogena, principalmente quando si utilizzano celle HEK 293. Dopo aver ottenuto risultati positivi, è possibile valutare lo splicing alternativo di specifici geni correlati alla risposta chemioterapeutica. Quando si osserva qualche effetto, questo semplice protocollo può indirizzare questi studi per percorsi più coerenti, dove la proteina svolge un ruolo regolando lo splicing alternativo nella risposta chemioterapica, per esempio.
