Questo protocollo fornisce metodi standard e riproducibili per valutare le risposte farmacologiche nelle colture organoidi della prostata. Le colture organoidi prostatiche forniscono un sistema in vitro che preserva molti aspetti della biologia in vivo e della risposta farmacologica consentendo alle cellule di adottare una struttura tridimensionale in una matrice di membrana basale. Siamo particolarmente entusiasti di utilizzare questi metodi per valutare come il genotipo detta la risposta farmacologica nella prostata e per modellare la resistenza ai farmaci.
Questi metodi possono essere applicati a sistemi di coltura organoide che utilizzano il metodo di placcatura a cupola. Tuttavia, i componenti nei media come i fattori di crescita possono differire a seconda del tipo di tessuto. La dimostrazione visiva consentirà una discussione più specifica e dettagliata delle fasi del protocollo e di come differiscono dai molti altri sistemi di coltura organoide pubblicati a disposizione dei ricercatori.
La coltura organoide richiede in genere più tempo rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. Assicurati di allocare più tempo per questi metodi. Inizia isolando gli organoidi prostatico dal topo o dal tessuto umano.
Tritare e digerire enzimaticamente il tessuto per produrre una singola sospensione cellulare, quindi raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti. Contare le cellule e rimornerne nella matrice della membrana basale. Quindi placcarli alla densità appropriata nelle cupole a matrice su piastre di coltura organoide prerifodate.
Le cupole dovrebbero essere a due millimetri l'una dall'altra e dal lato del pozzo. Una volta solidificato, aggiungere delicatamente i supporti dal lato del pozzo per evitare di interrompere la matrice. Dopo che le cupole si sono solidificate, aggiungere i supporti sopra la cupola in modo che siano completamente coperti.
Far crescere gli organoidi alla quantità desiderata per le applicazioni downstream determinando il numero di cella con metodi di conteggio standard. Quando gli organoidi sono pronti per l'uso, disegnare il mezzo con una pipetta Pten00 e pipettarlo su e giù per interrompere la matrice della membrana del seminterrato. Trasferire la sospensione su un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e lavare il pellet cellulare con cinque millilitri di PBS. Ripetere la centrifugazione, quindi sostituire il pellet in quattro millilitri di sostituzione della tripina e lasciare digerire per cinque-10 minuti mentre si trema a 37 gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di mezzo organoide con 10%FBS per inibire la sostituzione della tripina e centrifugare il tubo a 300 volte g per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di PBS. Quindi filtrare le cellule con un filtro da 40 micrometri per garantire la sospensione a singola cella e contarle utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare a 100 cellule per 10 microlitri utilizzando mezzo organoide con 10 inibitori della rho chinasi micromolare Y27632.
Trasferire 1.100 celle in un nuovo tubo conico e aggiungere 285 microlitri di matrice di membrana basale che si tradurrà in una concentrazione di matrice del 70%. Successivamente, seminare le cellule in 35 microlitri di cupole a matrice in una piastra pre-riscaldata da 24 pozzetti assicurandosi di placcare da tre a cinque repliche per campione. Capovolgere la piastra e posizionarla in un incubatore di celle per solidificare la matrice del seminterrato.
Dopo 10 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere il mezzo contenente l'inibitore della rho chinasi. Aggiornare il mezzo ogni due giorni e dopo sette giorni, contare il numero di organoidi stabiliti per cupola e calcolare la percentuale di organoidi formati dal numero totale di celle. Dopo aver isolato gli organoidi come descritto in precedenza, il seme da 1.000 a 10.000 cellule nella cupola della matrice usando l'efficienza di formazione organoide e la velocità di crescita come proxy per determinare il numero di cella finale.
Quindi seminare 35 microlitri di cupole a matrice in una piastra di 24 pozza e lasciare che la cupola si solidifichi. Aggiungere il mezzo contenente l'inibitore della rho chinasi e il farmaco di scelta. Eseguire un log 10 incrementale per determinare la concentrazione inibitoria della metà massima utilizzando il veicolo in cui il farmaco è stato sciolto come controllo.
Rinfrescare il mezzo ogni due o tre giorni e analizzare gli organoidi il settimo giorno per determinare la risposta farmacologica al farmaco eseguendo un saggio di vitalità cellulare come descritto nel manoscritto. Per placcare frammenti organoidi senza tripsicinazione, utilizzare una pipetta Pten00 per aspirare il mezzo e pipettare su e giù per interrompere la matrice della membrana basale. Quando la matrice è completamente interrotta, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Dopo il lavaggio, resospendare gli organoidi in un millilitro di PBS e interrompere gli organoidi per triturazione con una pipetta Pasteur in vetro. Quantificare il numero di frammenti organoidi e sementi cinque repliche con 100 frammenti come descritto in precedenza.
Sette giorni dopo, esegui un saggio di vitalità cellulare secondo le indicazioni manoscritte. Le cellule basali prostatiche di tipo selvatico hanno dimostrato una formazione organoide superiore rispetto alle cellule luminali. Un piccolo aumento della formazione organoide è stato ottenuto con la perdita mediata da CRISPR-Cas9 di Pten o P53 e la perdita di entrambi un'ulteriore maggiore capacità di formazione.
Gli effetti delle molecole anti-androgeniche sulla crescita sono stati testati in organoidi murini con diversi genotipi. La perdita di P53 non causò resistenza alle molecole anti-androgeniche, ma la perdita di Pten aumentò la resistenza. La doppia perdita di P53 e Pten, tuttavia, ha portato a una completa resistenza.
Anche l'inibizione del recettore degli androgeni ha alterato i fenotipi. Gli organoidi eliminati di tipo selvaggio Pten e P53 hanno dimostrato la diminuzione delle dimensioni del lume organoide, mentre gli organoidi con perdita di Pten e P53 non sono stati influenzati fenotipicamente. Come previsto, quando queste cellule sono state innesate per via sottocutanea nel fianco, solo i doppi organoidi Pten e P53 eliminati sono cresciuti.
Due distinti organoidi del cancro alla prostata umano MSKPCA2 e MSKPCA3 sono stati testati per la loro risposta alle molecole anti-androgeniche. La proliferazione degli organoidi MSKPCA2 è stata fortemente inibita, mentre gli organoidi MSKPCA3 sono rimasti inalterati. MSKPCA2 ha espresso alti livelli di recettori degli androgeni e FKBP5, nonché proteine luminali distintive.
MSKPCA3 espresse anche marcatori basali e mesenchimali e non mostrò alcuna espressione di FKBP5 suggerendo che questi organoidi modellano un fenotipo non luminale indipendente dagli androgeni. Gli organoidi devono essere interrotti periodicamente per tripinazione o triturazione con una pipetta di vetro per rimanere vitali. La frequenza dipende dall'origine e dal genotipo delle specie.
Qualsiasi tipo di sequenziamento o esperimento di proteomica di nuova generazione può essere eseguito seguendo le procedure descritte. Questi esperimenti studierno le basi molecolari dei fenotipi e delle risposte farmacologiche. Questa tecnica tridimensionale di coltura organoide consente ai ricercatori di studiare le risposte farmacologiche in un contesto genetico altamente controllato in vitro.
Questa può essere un'alternativa affidabile a lunghi studi in vivo.
