Abbiamo sviluppato un saggio ad alta produttività per misurare trappole extracellulari neutrofile, o NET. I NET sono strutture di DNA immunogeniche esposte dai neutrofili. I NET possono intrappolare e uccidere microrganismi e sono quindi un importante meccanismo anti-infettivo, ma svolgono anche un ruolo patogeno nelle malattie autoimmuni.
Con questa tecnica, i NET sono quantificati mediante microscopia confocale ad immunofluorescenza tridimensionale che si traduce in un metodo altamente sensibile e ad alta produttività per studiare la formazione e la degradazione della RETE. Questa tecnica ci consente di quantificare la formazione di NET di pazienti con malattie autoimmuni. Con questo saggio potrebbe essere monitorata la formazione ex vivo NET di pazienti con vasculite associata all'ANCA o eritematosi del lupus sistemico.
Inoltre, le potenziali terapie mirate alla formazione di NET potrebbero essere testate con questo saggio in vitro. L'isolamento dei neutrofili potrebbe essere una lotta per le persone che non hanno mai eseguito questa tecnica prima. Per iniziare questa procedura, ottenere 20 millilitri di sangue periferico da un donatore sano in due tubi codificati EDTA da 10 millilitri.
Trasferire 10 millilitri di sangue in un tubo sterile da 50 millilitri e PBS in un volume totale finale di 32,5 millilitri. Utilizzando un controller di pipetta e pipetta da 10 millilitri, assumere 14 millilitri di gradiente di densità. Posizionare la pipetta sul fondo del tubo da 50 millilitri.
Quindi, togliere il controller della pipetta dalla pipetta, consentendo al gradiente di densità di fluire per gravità fino a raggiungere il massimo per effetto capillare. Posizionare un pollice sopra la pipetta per evitare che il gradiente di densità rimanente perda, quindi rimuovere la pipetta dal tubo. Centrifugare il tubo a 912 volte g a temperatura ambiente per 20 minuti senza accelerazione o freno.
Rimuovere con cura l'anello bianco contenente prima le cellule mononucleari del sangue periferico, seguito dal plasma diluito da PBS. Infine, rimuovere il più possibile il livello gradiente di densità. Quindi, recuperare una bottiglia di acqua distillata sterile fredda e un pallone di PBS concentrato 10x da un frigorifero.
Lavorando rapidamente, aggiungere 36 millilitri dell'acqua direttamente sopra il pellet e mescolare con cura una volta. Dopo 20 secondi contati dall'inizio, aggiungere quattro millilitri di 10x PBS per creare una soluzione isotonica. E ancora, mescolare con attenzione.
Centrifugare il tubo a 739 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante, assicurandosi di essere estremamente attenti in quanto il pellet non è solido, e ripetere rapidamente il processo di aggiunta dell'acqua distillata sterile fredda e del PBS concentrato come descritto in precedenza. Centrifuga a 328 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di PBS. Conta i neutrofili e tienili sul ghiaccio. In primo luogo, effettuare una sospensione neutrofila contenente circa 10-20 milioni di neutrofili in due millilitri di PBS in un tubo da 15 millilitri.
In un diverso tubo da 15 millilitri, mescolare due millilitri PBS con quattro microlitri di collegamento a celle fluorescenti rosse a due micromolari. Aggiungere delicatamente la soluzione di collegamento a celle fluorescenti rosse alla sospensione neutrofila e mescolare con attenzione. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggere la miscela dalla luce e incubare per esattamente 25 minuti a 37 gradi Celsius per etichettare i neutrofili con il linker a celle fluorescenti rosse.
Disattivare l'etichettatura aggiungendo un mezzo RPMI 1640 contenente FCS inattivato al 10% a temperatura ambiente a un volume finale di 15 millilitri e mescolare una volta con attenzione. Se dopo di ciò si è formato un pellet, sospendere accuratamente la miscela. Centrifugare il tubo a 328 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.
Prima di rimuovere il supernatante, assicurarsi che si sia formato un pellet. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di mezzo RPMI 1640 privo di rosso contenente il 2%FCS a temperatura ambiente. Quindi, conta i neutrofili.
Effettuare una sospensione cellulare ad una densità di 420.000 cellule per millilitro in fenolo rosso-free RPMI 1640 mezzo contenente il 2%FCS. Aggiungere 37.500 neutrofili in 90 microlitri a ciascun pozzo di una piastra nera a 96 poggia-fondo. Successivamente, aggiungere 10 microlitri dello stimolo scelto in triplice copia per raggiungere una concentrazione del 10% in ogni pozzo.
Includere sempre un controllo negativo in triplice copia. Incubare al buio a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato, che varia da 30 minuti a due, quattro o sei ore. Quindi, preparare il volume di colorante di DNA impermeabile necessario per aggiungere 25 microlitri di colorante di DNA impermeabile a cinque micromolari per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare in ogni pozzo.
15 minuti prima della fine del tempo di incubazione, aggiungere 25 microlitri di colorante di DNA impermeabile a cinque micromolari ad ogni pozzo. Continuare l'incubazione per gli ultimi 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo questo, rimuovere il supernatante con molta attenzione e conservare se necessario.
Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4%. Tenere la piastra al buio e procedere immediatamente alla sezione successiva. Dopo aver configurato le impostazioni, selezionare Serie Z.
Selezionare 10 come numero di passaggi. Selezionare tre micrometri come dimensione del passo. Caricare la piastra nel microscopio confocale ad immunofluorescenza.
Fare clic sulla scheda Esegui. Compilare il nome e la descrizione della piastra e scegliere il luogo di archiviazione. Selezionare i pozzi che devono essere acquisiti.
Scegli il tempo di esposizione per Texas Red e FITC. Quindi, fai clic su Acquire Plate e inizia l'acquisizione, che richiederà circa un'ora per piastra. Successivamente, selezionare Analysis Macro.
Quindi selezionare w1 e scegliere il valore di soglia. Selezionare quindi il valore in pixel desiderato. Infine, in una seconda finestra Immagine J, selezionare w2 e scegliere il valore di soglia con il valore pixel desiderato.
Selezionare una destinazione per il file del foglio di calcolo, eseguire l'analisi e salvare successivamente il file di registro. Presentato qui è un saggio ampiamente applicabile altamente sensibile per la quantificazione semi-automatizzata della formazione di trappole extracellulari neutrofile per la valutazione dell'induzione es vivo di trappole extracellulari neutrofile su diversi stimoli. La formazione di NET è quantificata in modo tridimensionale quantificando il DNA extracellulare macchiato su 10 Z-stack con distanza di tre micrometri partendo dal piano focale in ogni pozzo.
Misurando l'area cumulativa, la sensibilità del saggio aumenta. L'area totale dei neutrofili macchiati imageati è quantificata solo nel piano focale in ogni pozzo che è significativamente correlato con il numero totale di neutrofili in ogni pozzo con un coefficiente di correlazione di Pearson di 0,99. Il risultato rappresentativo della quantificazione della formazione di NET nei neutrofili è espresso come area cumulativa di DNA extracellulare macchiato su 10 Z-stack per neutrofilo immagine.
Vengono quindi scattate istantanee del saggio di quantificazione netto. Immagini rappresentative di neutrofili non stimolati e di NET nei neutrofili stimolati dall'AAV sono mostrate qui con i neutrofili etichettati fluorescenti in rosso e il DNA extracellulare macchiato in verde. I neutrofili devono essere maneggiati con cura e l'etichettatura PKH deve essere eseguita esattamente secondo il protocollo.
Questo saggio può essere usato per studiare morfologia, cinetica e composizione dei NET. Questa tecnica è un altro metodo che offre la possibilità di studiare i NET in salute e malattia. Trypan blu, PKH e PFA devono essere maneggiati con guanti e non devono essere respirati direttamente.
