I vettori virali possono introdurre materiale genetico nelle cellule per compensare i geni difettosi, per regolare importanti proteine della crescita o per produrre marcatori in grado di tracciare i circuiti neurali. Introdurre vettori virali nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate. L'iniezione diretta nel tessuto del midollo spinale aggira queste barriere, consentendo l'accesso a corpi cellulari o sinapsi.
Indirizzare correttamente i livelli spinali da L1 a L4 può essere difficile. È importante utilizzare punti di riferimento per verificare il bersaglio e ricordare che questi segmenti si allineano alle vertebre da T11 a T13. Il giorno della procedura, collegare l'iniettore alla micropompa e posizionare la micro-pompa in un micromanipolatore con una scala vernier.
Utilizzare una siringa con un ago flessibile per caricare con cura una tintura colorata in uno degli aghi di vetro e inserire l'ago di vetro nell'iniettore. Quindi confermare che l'ago viene seminato correttamente nelle rondelle e che il cappuccio dell'iniettore è avvitato su stretto e che l'ago dell'iniettore in acciaio viene esteso circa tre quarti della lunghezza dell'ago di vetro. Prima di iniziare la procedura, scongelare almeno un microlitro, più un piccolo volume di virus extra per iniezione dalla conservazione del congelatore, e confermare la mancanza di risposta del pizzico in un ratto anestetizzato.
Radersi lungo la linea mediana dorsale dai fianchi all'angolo inferiore delle scapole dell'animale, tirando la pelle tesa per una rasatura più facile e precisa, e disinfettare la pelle esposta con 5%iodio sequenziale e 70% scrub di etanolo. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Quindi posizionare l'animale su un panno sterile e posizionare la garza sotto la vescica per raccogliere qualsiasi urina.
Per identificare il sito dell'incisione cutanea, premere delicatamente le dita all'ultima costola per localizzare la vertebra L1. Usando questa vertebra come punto di riferimento e tenendo la pelle tesa da una delicata diffusione mentre si preme saldamente con il bisturi, utilizzare una lama chirurgica numero 10 per fare un'incisione scuoiata da tre a quattro centimetri che termina appena inferiore a L1 per esporre il muscolo. Usa le forcep e le forbici per sentire i processi spinosi.
Fare piccoli tagli rostrali per lasciare spazio per afferrare saldamente su un processo superiore con forcende di denti a topo. E fare due lunghi tagli profondi il più vicino possibile ai processi. Dopo aver assicurato i muscoli laterale in posizione, cancellare il muscolo intorno ai processi per determinare la forma delle loro teste.
Quindi visualizzare le forme delle teste dei processi spinosi al fine di identificare il sito di laminectomia. I processi T11 e T12 e T13 di giunzione saranno il sito della laminectomia. Una volta che l'area bersaglio è stata correttamente identificata, stendere delicatamente le vertebre per rivelare i legamenti intervertebrali e utilizzare i rongeurs per prendere piccoli morsi dei processi spinosi e l'aspetto dorsale delle vertebre.
Rimuovere l'osso dalla linea mediana in modo che il vaso sanguigno della linea mediana possa essere osservato, lasciando una finestra che rivela chiaramente il tessuto del midollo spinale ed è privo di detriti. Quindi fissare le forcep stabilizzanti ai processi spinosi rostrali e caudali alla finestra della laminectomia per fissare l'animale in un supporto spinale. E sollevare l'addome dell'animale per negare l'effetto dei movimenti respiratori.
Per caricare il virus nell'iniettore, pipettare circa cinque microlitri del materiale scongelato su un pezzo di Parafilm e posizionare gli aghi di vetro in modo che la punta sia all'interno della goccia. Utilizzare la micropompa per prelevare fino a quattro microlitri di virus ad una velocità da 20 a 100 nanolitri al secondo e impostare il controller per iniettare prima di rilasciare una piccola quantità di virus dalla punta dell'ago per assicurarsi che non sia bloccato. Pulire qualsiasi virus in eccesso con una salvietta da laboratorio e posizionare i micromanipolatori in modo che la scala vernier sia visibile.
Posizionare l'ago sulla linea mediana del midollo spinale e utilizzare la scala vernier sul micromanipolatore per dirigere l'ago lateralmente di 0,8 millimetri. Quindi abbassare l'ago alla corda spinale fino a quando non sta rientrando, ma non forando, la dura, e utilizzare un rapido movimento di torsione per forare la dura con l'ago fino a quando la punta dell'ago non è affondata a una profondità di 1,5 millimetri. Una volta che l'ago è in posizione, programmare l'iniettore per consegnare il virus ad una velocità di 400 nanolitri al minuto e confermare che il virus sta entrando nella corda spinale osservando l'avanzamento del fronte del colorante.
Una volta terminata l'iniezione, lasciare riposare l'ago nel midollo spinale per due o cinque minuti per facilitare la diffusione del virus, prima di ritirare lentamente l'ago per il posizionamento nel sito di iniezione successivo. Dopo l'ultima iniezione, rimuovere l'animale dal supporto spinale per consentire la rimozione di tutti i dispositivi utilizzati per diffondere il muscolo laterale. Quindi chiudere il muscolo con una sutura di catgut cromato 4.0 e graffettare la pelle con clip ferite da nove millimetri.
Quattro settimane dopo un'iniezione riuscita, si osserva una significativa espressione di GFP nei neuroni all'interno della materia grigia del midollo spinale toracico sul lato, ipsilaterale all'iniezione. Nella materia bianca, l'espressione della GFP si osserva negli assoni nel cordone ipsilaterale, specialmente nelle aree tipiche degli assoni propriospinali. Un maggiore ingrandimento dei neuroni della materia grigia rivela un esempio di tipica espressione del segnale nei corpi cellulari neuronali e nei dendriti.
L'espressione della GFP nei neuroni può essere osservata anche nei nuclei del tronco encefalico, come all'interno della formazione reticolare pontina. I fattori chiave per una procedura di iniezione del midollo spinale di successo sono il corretto targeting vertebrale e la garanzia che il virus entri nel tessuto Se viene eseguita una lesione del midollo spinale rostrale prima di questa procedura, è possibile utilizzare l'iniezione diretta per rintracciare i neuroni che ristabilivano le connessioni intorno alla lesione.
