L'ictus è la principale causa di mortalità e disabilità in tutto il mondo. Sebbene la trombolisi e la rimozione chirurgica dell'occlusione vascolare cerebrale possano essere eseguite in pazienti selezionati, vi è ancora l'urgente necessità di terapie efficaci contro l'ictus. Qui, dimostriamo un'erogazione intra-arteriosa a base di catetere di cellule staminali nell'emisfero ischemico come potenziale regime per la terapia dell'ictus.
In primo luogo, introduciamo come preparare il catetere a iniezione e i ganci chirurgici. Abbiamo progettato due tipi di cateteri di iniezione per iniezione intra-arteriosa. Il progetto uno viene utilizzato per l'iniezione di una soluzione o sospensione che non richiede il lavaggio del tubo.
La progettazione due consente l'iniezione di cellule staminali neurali, seguita da uno scarico del volume morto per fornire l'intero volume. Per costruire un set di cateteri di iniezione, avrai bisogno di aghi calibro 26 e calibro 20, una lunghezza da 10 a 15 centimetri di catetere MRE 25 e una lunghezza di tre centimetri di cateteri MRE 50 e MRE 10. Tagliare entrambe le punte dell'ago e lucidare l'estremità metallica su carta vetrata per riaprire il tubo e lisciare i bordi e quindi lavare con acqua distillata per pulire il foro e lavare via i detriti.
La figura mostra un'estremità chiusa di un ago calibro 20 dopo aver ritagliato la punta dell'ago, che viene riaperta con un foro liscio dopo la lucidatura. Al microscopio, inserire l'ago calibro 20 all'estremità del tubo MRE 50. Piegare l'ago calibro 26 e quindi penetrare nel tubo sotto l'estremità della punta dell'ago calibro 20.
Fissare l'ago calibro 26 con super colla. Quindi incorporare i due mozzi dell'ago e i tubi ed epossidici per costruire un blocco solido per migliorare la resistenza. Avrai anche bisogno di tre ganci chirurgici per tenere il tessuto in posizione per una migliore esposizione dei siti chirurgici.
Tagliare un albero dell'ago lungo da uno e mezzo a due centimetri da un ago calibro 27 e lucidare entrambe le estremità su carta vetrata fino a quando non sono opache. Utilizzare un piccolo morsetto emostatico per piegare l'albero in un gancio ad un'estremità e a forma di anello all'altra estremità. Inserire un catetere MRE 25 lungo da 10 a 15 centimetri attraverso l'anello e fissare con nastro chirurgico chiaro.
Crea altri due hook usando lo stesso metodo. I ganci e il sistema di catetere dovrebbero essere immersi durante la notte in etanolo al settanta per cento per la sterilizzazione. Tutte le procedure riguardanti materie animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Kentucky.
Usiamo il cervello del topo embrionale ENT per coltura della GFP, cellule staminali neurali positive. Gli embrioni positivi alla GFP possono essere facilmente visualizzati nel canale FITC su un microscopio fluorescente. Mentre gli embrioni di tipo selvatico non mostrano fluorescenza usando la stessa esposizione.
L'autofluorescenza degli embrioni di tipo selvatico è visibile solo quando il tempo di esposizione è aumentato 100 volte. La corteccia embrionale viene raccolta e utilizzata per stabilire colture di cellule staminali neurali seguendo il protocollo del produttore. Queste cellule staminali neurali possono formare neurosfere e possono passare per 10 generazioni e possono differenziarsi in glia sono neuroni.
Pannelli di marcatori di cellule staminali embrionali come nanog, SSEA1, Oct4 e Sox3 possono essere utilizzati per identificare le proprietà delle cellule staminali mentre si trova nelle neurosfere. Le neurosfere sono state coltivate nei media, seguendo il protocollo del produttore e l'uso tra i passaggi tre e cinque per la consegna di cellule staminali neurali. L'ictus ischemico è stato indotto nell'emisfero sinistro sia per topi che per ratti, usando un'occlusione dell'arteria cerebrale media a base di filamento, MCAO con alcune modifiche a seconda della specie.
Nei topi, il filamento viene inserito attraverso la comune arteria carotide, CCA e avanzato nell'arteria carotide interna, ICA. Mentre è nei ratti, il filamento viene introdotto attraverso l'arteria carotide esterna, ECA nell'ICA a causa del più ampio spazio di lavoro. Qui dimostriamo l'intervento al topo.
Dopo aver fatto un'incisione della linea mediana lungo il collo, separare i tessuti sottostanti usando la dissezione smussata. Utilizzare i tre ganci microchirurgici realizzati con alberi ad ago calibro 27 per ottenere un campo visivo migliore. Il quadrato nero indica l'area chirurgica per il passaggio successivo.
Lo strato muscolare sopra il CCA sinistro è accuratamente aperto per esporre il CCA sinistro e il nervo vago. Seguire il CCA fino a raggiungere e identificare la biforcazione. Si deve prestare attenzione a non allungare, spostare o spremere questo nervo CCA o vago.
Aprire con cura il tessuto connettivo chiaro, coprendo il CCA e il nervo vago. Liberare lo spazio sotto questo CCA con una punta delle forcep e isolare il più possibile lo stelo CCA. Infilare una sutura chirurgica in nylon intrecciato a sei o intrecciati sotto il CCA.
Tagliare il punto centrale per lasciare alle suture sottostanti il CCA. Posizionare un'altra sutura di nylon sotto il CCA. Legare uno slipknot sulla sutura superiore, tenendolo libero.
Separare le due suture inferiori. Legare un nodo di slittamento con la sutura centrale, mantenendola sciolta per ora. Legare il nodo di un chirurgo con una sutura inferiore e spostarlo all'estremità prossimale il più lontano possibile.
Tagliare le estremità della sutura. Esporre ulteriormente il CCA oltre la biforcazione. Spingere lo slipknot sciolto superiore alla biforcazione e stringerlo per evitare il riflusso di sangue.
Posare la sutura MCAO in nylon 70 rivestita in gomma di silicio accanto alla CCA. Usando micro forbici, tagliare una piccola incisione sul CCA, accanto al nodo inferiore. Inserire la punta della sutura MCAO nel CCA attraverso questa incisione e avanzare verso il nodo superiore.
Regolare la posizione del nodo centrale e stringerlo fino a quando non può mantenere la sutura MCAO in posizione. Non stringere eccessivamente il nodo. Rilasciare il nodo superiore, ma fare un altro nodo di slittamento sciolto nella stessa posizione.
Far avanzare la sutura MCAO nell'ICA. Confermare che la sutura MCAO passa la biforcazione nell'ICA. Il percorso della sutura dovrebbe essere relativamente dritto, entrando più in profondità nel tessuto mentre avanza.
Controlla il pennarello d'argento all'estremità della sutura. Assicurarsi che raggiunga la biforcazione. Controllare di nuovo la direzione della sutura MCAO.
Regolare i nodi superiore e centrale per evitare perdite di sangue. Avanzare ulteriormente la sutura MCAO, stringere i due nodi superiori per fissare la sutura MCAO in posizione. Inizia a registrare il tempo per un'ora di ischemia.
Dopo un'ora di ischemia, anestetizziamo l'animale e riapriamo la ferita della pelle. Esponi l'area chirurgica. Individuare gli slipknot superiori e medi.
Rilasciare delicatamente il nodo superiore. Estrarre delicatamente la sutura MCAO fino a quando la parte in gomma siliconica bianca raggiunge il nodo centrale. Stringere il nodo superiore per mantenere la sutura MCAO in posizione per evitare sanguinamenti.
Rilasciare delicatamente lo slipknot centrale. Estrarre la sutura MCAO fino a quando la sua estremità non passa il nodo superiore. Stringere il nodo superiore.
Posizionare lo slipknot centrale proprio sopra l'incisione sul CCA. Stringi lo slipknot centrale. Rimuovere il nodo superiore.
Tagliare le estremità della sutura del nodo centrale. Chiudi la ferita della pelle e lascia che l'animale si riprenda. Sulla base della nostra esperienza, le cellule staminali neurali iniettate in modo sicuro attraverso questa via arteriosa tra uno e tre giorni dopo l'ictus.
Ancora una volta, ci sono piccole variazioni tra gli interventi chirurgici del topo e del ratto per l'iniezione di cellule staminali neurali. E qui dimostriamo l'intervento al topo. Il terzo giorno post-ictus, anestetizza l'animale, riapre la ferita e risporse il CCA.
Posare una sutura chirurgica a doppio filamento sotto il CCA e tagliarla al punto centrale per ottenere due suture. Posizionare correttamente le due suture. Fai uno slipknot con la sutura superiore.
Posizionarlo proprio sotto la biforcazione. Stringi lo slipknot superiore. Fai un altro slipknot con la sutura centrale.
Tagliare una piccola incisione proprio sopra il nodo tagliato rimanente dall'intervento chirurgico all'ictus. Tagliare la punta del catetere MRE 10 con un angolo di circa 45 gradi. Utilizzare questa estremità affilata per inserire l'incisione sul CCA.
Fare attenzione a regolare correttamente l'angolo di entrata e la forza utilizzata per inserire il catetere. In caso contrario, il catetere potrebbe non entrare nel CCA o perforarlo. Inserire il catetere e avanzare fino a quando la punta raggiunge il nodo superiore.
Stringere lo slipknot centrale per tenere il catetere in posizione e assicurarsi che non vi sia alcun legame sanguigno. Rilasciare il nodo superiore. Fai un nodo di slittamento con la sutura superiore.
Regolare l'angolo del catetere all'interno del CCA e le posizioni di entrambi i nodi fino a quando non è visibile un rapido riflusso di sangue, indicando una comunicazione riuscita tra il catetere e il flusso CCA. Avviare la pompa della siringa. Il sangue nel catetere verrà riportato nel CCA.
Terminare l'iniezione dopo cinque minuti. Ligate il nodo superiore. Rilasciare il nodo centrale e ritirare il catetere.
Ligate il nodo centrale. Tagliare tutti i nodi. Chiudi la ferita e lascia che l'animale si riprenda.
Dopo l'iniezione intra-arteriosa, le cellule staminali neurali etichettate GFP si trovano principalmente nell'emisfero ipsilaterale. Qui, mostriamo la distribuzione nel giro dentato ippocampale un giorno dopo l'iniezione. Nell'emisfero ipsilaterale, alcune delle cellule staminali neurali positive del GFP localizzate nella corteccia e nello striato, esprimono il doppio cort, un marcatore dei neuroni immaturi.
Queste sono immagini rappresentative di animali finti e accarezzati con o senza iniezione di cellule staminali neurali a sette giorni dall'iniezione. A 30 giorni dalla consegna, è possibile rilevare solo una piccola fluorescenza automatica attraverso il canale FITC negli animali che ricevono l'iniezione del veicolo. Mentre nelle cellule staminali iniettate animali, le cellule staminali neurali etichettate GFP possono essere trovate nel cervello ferito con espressione di vari marcatori cellulari come il marcatore gleo GFP o il marcatore neuronale tujuan.
Le frecce bianche in ogni immagine indicano cellule staminali neurali che esprimono rispettivamente marcatori GFP o tujuan. In conclusione, l'iniezione intra-arteriosa è un metodo fattibile per la somministrazione di cellule staminali neurali per la terapia dell'ictus. Le cellule staminali neurali possono sopravvivere e differenziarsi in diversi tipi di cellule all'interno del cervello ferito.
E infine, il metodo di iniezione intra-arteriosa qui introdotto può essere utilizzato anche per la consegna di soluzioni e sospensioni.
