Ringraziamo Kyle Stehlik, Natasha Wilkins, e Matt Runquist assistenza sperimentale. Finanziato attraverso la ricerca e l&#39;istruzione Iniziativa Fund, un componente del Advancing una dotazione sano Wisconsin presso il Medical College of Wisconsin, e la Neilsen Fondazione Craig H..

NOTA: Etica Statement: La cura istituzionale e Usa Comitati (IACUC) del Medical College del Wisconsin e il Clemente J. Zablocki VA Medical Center hanno approvato tutte le procedure. Preparazione degli animali 1. e monitoraggio <ol><li> Anestetizzare il topo in una camera di induzione, utilizzando 5% isoflurano in aria medicale. Quando il riflesso di raddrizzamento è assente e comprimendo la zampa posteriore non produce ritiro riflesso, ridurre l&#39;anestesia al 2% e trasferire l&#39;animale al letto scanner in posizione prona testa prima. Mantenere 2% isoflurano attraverso un dispositivo cono tutta la procedura e mantenere aria medica ad una portata di circa 1 L / min. Applicare una piccola quantità di lubrificante unguento per gli occhi del ratto per evitare danni alla cornea mentre sotto anestesia. </li><li> Posizionare una cintura di monitoraggio respiratorio saldamente intorno torso del ratto. Collegare la cinghia ad un sistema gating respiratorio. Prima di avanzare il ratto nel foro scanner, chec<html> k computer monitoraggio respiratorio per accertare il ciclo respiratorio è chiara e coerente. Regolare la cinghia se necessario, dal momento che questo passo è imperativo per la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Monitorare e mantenere la temperatura corporea dell&#39;animale a 37 ° C attraverso una sonda rettale e sistema di riscaldamento di aria calda. Mantenere la frequenza respiratoria tra 30-45 respiri al minuto, regolando il livello di anestesia tra 1,2 e 2%. </li><li> Posizionare il ratto nel supporto testa con un morso bar ea vite a barre orecchio (Figura 1), e far scorrere la testina in una bobina di volume quadratura fino alla colonna cervicale è posizionato al centro della bobina. NOTA: le spalle del ratto può prevenire l&#39;ulteriore progressione nella bobina. </li><li> Far avanzare il ratto e titolari di supporto nel foro scanner. Se del caso, regolare l&#39;accordatura e condensatori di corrispondenza della bobina alla frequenza adeguata e impedenza secondo le istruzioni fornite dal produttore della bobina. </li></ol>e_title &quot;&gt; Parametri di scansione 2. MRI NOTA: Le procedure descritte qui utilizzato un sistema piccolo animale 9.4 T foro orizzontale, ma sono applicabili ad altri punti di forza del campo di piccoli sistemi di risonanza magnetica animale. <ol><li> Utilizzare procedure automatizzate del sistema MRI per il rilevamento della frequenza di risonanza, migliorando iterativamente l&#39;omogeneità del campo magnetico (spessori), la calibrazione della potenza a radiofrequenza, e la regolazione del guadagno del ricevitore. </li><li> Utilizzando l&#39;interfaccia software del sistema, di ottenere una tre-piano di scansione esploratore di default per assicurare il corretto posizionamento. <ol><li> Fare clic su &quot;Nuova scansione&quot;, selezionare tripilot, e fare clic su &quot;semaforo&quot; per acquisire le immagini. </li><li> Assicurarsi che il centro della colonna cervicale è allineato sia al centro del magnete e il centro della bobina MRI. Per centrare la colonna vertebrale all&#39;interno del magnete, spingere o tirare il supporto e riacquistare la scansione esploratore per la verifica. </li><li> Per regolare la position della colonna cervicale rispetto alla bobina MRI, rimuovere il supporto dal magnete per il riposizionamento. Se necessario, ripetere questo processo fino a quando la posizione è coerente. Se l&#39;animale è riposizionato, ripetere il punto 2.1. </li></ol></li><li> Aggiungi un ponderato sequenza spin-echo nuova diffusione eco-planare (DtiEpi) al protocollo di imaging corrente. <ol><li> Configurare e acquisire immagini ponderate di diffusione con la sequenza DWI utilizzando le impostazioni predefinite, tranne per quanto segue: </li><li> Aprire la posizione dell&#39;interfaccia grafica fetta di prescrivere 12 fette con uno spessore di 0,75 mm. Orientare le fette perpendicolare all&#39;asse principale del midollo cervicale. Garantire posizionamento fetta consistente tra animali diversi o attraverso sessioni di imaging diversi utilizzando la base del cervelletto come riferimento interno. </li><li> Impostare le bande di saturazione su &#39;on&#39;. Posizione 4 bande saturazione con uno spessore di 10 mm al di fuori del midollo spinale per minimizzare il segnale da questi tessuti eridurre la loro capacità di indurre artefatti (Figura 3). Impostare gating respiratorio (&#39;modulo trigger&#39;) a &#39;on&#39;. NOTA: Il gating respiratorio personalizzato richiede conoscenza ed esperienza nella programmazione sequenza di impulsi. Se questo non è disponibile, una soluzione è quella di ridurre il numero di fette di 3-5 e il TR a 1 s per garantire che tutte le fette sono ottenuti in-tra respiri dell&#39;animale. Ripetere la sequenza completa con l&#39;altro sottoinsieme di fette avere la copertura completa del midollo cervicale. </li><li> Fare clic sull&#39;icona Casella degli strumenti e quindi fare clic su &quot;Modifica metodo.&quot; Imposta il numero di segmenti EPI a 4. Cambiare la direzione della codifica di fase a sinistra-destra. Altre impostazioni di default dovrebbero essere: eco spacing = 0,3234 ms, lunghezza del treno eco totale per segmento EPI = 32. NOTA: La codifica di fase impostato nella direzione sinistra-destra piuttosto che antero-posteriore ridurrà la contaminazione del moto da altre strutture. </li><li> Utilizzare i seguenti geometriImpostazioni cal. Size Matrix = 128 x 128, e in piano campo di vista = 25,6 x 25.6 mm, in una risoluzione spaziale in piano = 0,200 x 0,200 millimetri. Garantire spessore di strato = 0.75 mm. Ordine Slice = &#39;intercalata&#39;, gap fetta = 0 mm. </li><li> Utilizzare le seguenti impostazioni di ponderazione diffusione: DW modalità misura = &#39;Contrasto DW&#39;, durata gradiente di diffusione (δ) = 7 ms, separazione gradiente di diffusione (Δ) = 12 ms, numero di valori b = 8, desiderati valori b = 0 , 250, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.500, 3.500 millimetri / s 2, numero di direzioni di diffusione = 2, ponderazione diffusione indicazioni = [1 0 0] e [0 0 1] (fatto per essere nei piani paralleli e ortogonale all&#39;asse del midollo spinale). NOTA: Con queste impostazioni, abbiamo raggiunto valori b alto come 3.500 s / mm 2. Specifiche hardware e le altre caratteristiche di prestazione di sistema può limitare il valore-b, dal momento che la durata gradiente di diffusione (δ) e la separazione gradiente di diffusione (Δ) dipendono dal gprestazioni gardiente, che sul nostro sistema sono stati: (massima forza di gradiente: 440 mt / m, massima velocità di risposta: 3.440 T / m / s). Per le misure di curtosi, 2 B-valori, con la b valore più alto di almeno 2.000 s / mm 2, sono raccomandati. </li><li> Utilizzare le seguenti impostazioni di sincronizzazione. tempo di eco (TE) = 27 ms (impostato al minimo inserendo 0), tempo di ripetizione (TR) = 1.800 msec. </li></ol></li><li> Acquisire la sequenza preparata. Con i parametri sopra elencati, il tempo totale di acquisizione è di circa 25 min. </li><li> Durante tutte le scansioni, monitorare il software gating respiratorio e regolare il periodo di ritardo tra il &quot;trigger&quot; (rilevamento software di scadenza) ed il segnale al sistema MRI in modo che le acquisizioni si verificano solo in quiescente (immobile) porzione del ciclo respiratorio (Figura 2a, porzione stabile di linea grigia). Un ritardo di trigger tra 100-400 msec è necessario a seconda del modello di respirazione dell&#39;animale. Ciò contribuirà a ridurre artifatti che si verificano con il movimento respiratorio (Figura 3e). </li><li> Se disponibile, ripetere la sequenza con il costume &quot;reverse blip&quot; impostato su &#39;on&#39;, che richiede altri 25 minuti di tempo di acquisizione. NOTA: Se il costume &#39;reverse-blip&#39; sequenza di 9 (necessario per la correzione di suscettibilità artefatto durante la fase 3) non è disponibile, solo un singolo EPI direzione della codifica di fase è possibile, mentre la modifica sequenza di blip invertito consente la scelta della fase di codifica direzione (a destra -per-sinistra o da sinistra a destra). </li><li> Quando l&#39;imaging, rimuovere l&#39;animale dal supporto e riportarlo alla sua gabbia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. </li></ol> Elaborazione 3. Immagine <ol><li> Esportare dati dal sistema in formato DICOM direttamente dal sistema (preferibile) o convertire i dati in formato Nifti utilizzando personalizzato o thirsoftware d-party. </li><li> Eseguire la suscettibilità di correzione artefatto. <ol><li> Estrarre il b = 0 volumi di ogni scansione in un unico file, utilizzando le utility fornite con FSL o altri pacchetti software MRI. È richiesto un file per ogni direzione della codifica di fase. NOTA: Ad esempio, se ogni scansione consisteva di 8 scansioni di varia valori b con coefficiente di diffusione in direzione trasversale, seguito da 8 scansioni di ponderazione diffusione nella direzione longitudinale, il file di immagine contiene b = 0 scansioni nel 1 ° e 9 volumi th, e possono essere estratti e assemblati con il seguente codice shell: fslroi $ {up} _dwi_masked.nii.gz temp1 0 1 fslroi $ {up} _dwi_masked.nii.gz temp2 8 1 fslroi $ {} giù _dwi_masked.nii.gz TEMP3 0 1 fslroi $ {} giù _dwi_masked.nii.gz temp4 8 1 fslmerge -t blip_both temp1 temp2 TEMP3 temp4 (Dove in questo caso $ su e giù $ sono le scansioni con normale e invertito le direzioni fase di codifica, rispettivamente). </li&gt; <li> Utilizzare il comando &#39;topup&#39; in FSL 10,11 per creare un file corretto con ridotte artefatti distorsione dell&#39;immagine. Applicare questa correzione alle immagini DWI prime da utilizzare per la creazione di mappe di parametri. NOTA: Istruzioni per l&#39;uso del comando sono disponibili all&#39;indirizzo <a href="http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide">http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide</a> . Esempio di codice per utilizzare il comando in questo caso è il seguente: topup --imain = blip_both_nlmf_b0images_masked.nii --datain = .. / topup_data.txt --config =. / b02b0_ratspine.cnf --out = topup_splines_nlmf --iout = $ out --verbose --logout = topuplog.log dwiup = `ls $ {} fino * dwi_nlmFilt.nii` dwidown = `ls $ {} giù * dwi_nlmFilt.nii` applytopup --imain = $ {} dwiup, $ {} dwidown --datain = .. / topup_data.txt --method = jac --inindex = 1, $ ind --topup = topup_splines_nlmf --out = DWI _ $ {out } -v Copiare e modificare il file di default in $ {} FSLDIR /etc/flirtsch/b02b0.cnf per la rotazione di rattoal cavo riducendo ciascuno dei valori nelle --warpres e linee --fwhm di un fattore 10. </li></ol></li><li> Se le immagini con ponderazione diffusione vengono acquisiti lungo almeno 6 direzioni non ortogonali (utilizzando uno schema DTI in Paravision o un design personalizzato simile), utilizzare pacchetti software come di fsl diffusione Toolbox 12 o Camino 13 per calcolare le mappe dei parametri DTI standard. Altrimenti, utilizzare una procedura personalizzata per generare metriche utili, che impiega ponderazione diffusione solo lungo 2 direzioni, per esempio, come indicato in passi 3.4 in poi. </li><li> Caricare il file DWI corretto in uscita da topup in fslview e selezionare &quot;File -&gt; Crea maschera&quot; dal menu. Utilizzare gli strumenti matita per disegnare una regione di interesse all&#39;interno di un tipo di tessuto (per esempio GM, WM dorsale, o ventrolaterale WM). Salvare il file e ripetere per tutte le altre ROI desiderati da utilizzare in seguito. NOTA: Altre procedure a ROI segmento del midollo spinale sono stati documentati 14,15 </sup&gt; e può essere preferibile per gli utenti avanzati. </li><li> Utilizzare il file ROI per mascherare il file DWI e quindi calcolare il segnale di media all&#39;interno del ROI per ogni volume immagine utilizzando il seguente comando: fslstats -t DWI_corrected.nii.gz -k GM_mask.nii.gz -M </li><li> Copiare i primi 8 risultati nel programma di calcolo numerico come MATLAB, come un vettore per il segnale trasversale (per esempio chiamare sig_T), ed il secondo 8 risultati come un vettore per il segnale longitudinale (sig_L), dove 8 è il numero di b- valori utilizzati. <ol><li> Copiare i b-valori in un programma di calcolo numerico come un vettore di 8 B-valori. Il B-valori per le direzioni trasversali e longitudinali erano identici. Se possibile, il b-valore effettivo, piuttosto che il b-valore nominale, devono essere ottenuti dallo scanner, che è elencato nella finestra dei parametri dal punto 2.3.5 come &quot;valore effettivo B&quot;. </li><li> Utilizzare curva toolbox raccordo del programma di calcolo numerico per adattarsi al segnale vs. dati b valore a The voluta modello digitando cftools al prompt dei comandi. Per fare questo, fare clic su &quot;Dati ...&quot; e selezionare i vettori del segnale come Y-dati e le b-valori come x-dati. Fare clic su &quot;Fitting ...&quot; e sotto &quot;Tipo di fit&quot; scegliere &quot;Custom Equation&quot;, quindi fare clic su &quot;Nuovo&quot; e &quot;equazioni generali&quot; per inserire un&#39;equazione per il montaggio. </li></ol></li><li> Per adattare il modello di diffusione di serie, immettere l&#39;equazione: S0. * Exp (-x. * D) &quot;(1) </li><li> Per adattare ad un modello che include la diffusione e un secondo termine di ordine (curtosi, K) per misurare la deviazione dalla diffusione gaussiana 16, digitare l&#39;equazione: S0. * Exp (-x. * D + (1/6). * (X. * D). ^ 2. * K) &quot;(2) </li><li> Fare clic su &quot;OK&quot; e &quot;Apply&quot;. Osservare i valori stimati per diffusività (D) e curtosi (K) sulla finestra di uscita. Nel &quot;set di dati:&quot; il selettore, selezionare i dati sig_T (o sig_L) per l&#39;uso con l&#39;equazione (1)o (2) e fare clic su &quot;Applica&quot;. </li><li> Calcolare l&#39;indice di anisotropia (AI) con la trasversale e diffusività longitudinale: AI = (D L -D T) / (D + D T L) (3) Questo è analogo alla anisotropia frazionaria (FA) calcolata dal modello DTI. Un indice anisotropia per kurtosis può essere calcolata utilizzando trasversale e longitudinale kurtosis al posto di diffusività. NOTA Questo metodo fornisce valori dei parametri del modello come K T, D T, ecc E &#39;anche possibile utilizzare l&#39;operazione di riga di comando della curva strumenti montaggio su ciascun voxel all&#39;interno della colonna vertebrale per creare una mappa di ogni parametro del modello . Metodi di montaggio alternativi possono essere utilizzati e sono descritti altrove. 17 </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+tensor+imaging+of+the+mouse+brainstem+and+cervical+spinal+cord.">Diffusion tensor imaging of the mouse brainstem and cervical spinal cord.</a> Nat Protoc. 8 (2), 409-417 (2013).</li></ol>

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Le tecniche descritte qui di diffusione in grado di fornire immagini di alta qualità ponderato del midollo spinale di ratto in vivo. La qualità dell&#39;immagine dipende da molti fattori, ma il midollo spinale ha diversi problemi specifici che sono importanti. Motion è un importante problema che, se non corretta, si tradurrà in immagini inutilizzabili. Quindi, è necessario un attento monitoraggio durante la sessione MRI. Se gli artefatti di immagine si osservano sulla scansione iniziale che sono coerenti con il movimento, fermare l&#39;acquisizione e prendere misure per eliminare gli artefatti, poiché questi sono difficili da rimuovere in post-processing. Accertarsi che il computer respiratoria riceve un segnale forte regolare dall&#39;unità di monitoraggio respiratorio. La cinghia la respirazione può essere necessario regolare la tensione corretta che fornisce un segnale di coerenza, ma non limita il respiro dell&#39;animale. Mantenere il livello adeguato di anestesia in ogni momento; 1,5-2,0% isofluorano è stato usato nella nostra experience. Analogamente, riduzione del movimento complessivo dell&#39;animale e la colonna vertebrale è un altro aspetto importante per fornire immagini prive di artefatti. A differenza del midollo spinale umano, che sperimenta il movimento significativo causato da CSF pulsazione relative al ciclo cardiaco, CSF pulsazione nei roditori è prevalentemente associata con il ciclo respiratorio 18. Mentre è difficile eliminare completamente tutti i movimenti del cavo, è particolarmente importante ridurre il moto per quanto possibile, che viene spesso realizzata tramite tentativi ed errori. Inoltre, ratti con varie lesioni neurologiche o disturbi possono avere tassi respiratori anomali o altre complicazioni fisiologiche che possono richiedere l&#39;adattamento delle procedure descritte nel presente documento. Le modifiche alla sequenza di impulsi per gating respiratorio, insieme con immagine procedure di ricostruzione adatti per questo scopo, minimizzare gli effetti di distorsione provocati da campi magnetici omogenei che non possono essere removcato da rettifiche effettuate sul sistema MRI. Analogamente, la qualità dell&#39;immagine dipende dalla durata del tempo di imaging. Nel nostro esempio, limitando il numero di ponderazione diffusione lungo due direzioni attivata una riduzione del tempo totale di imaging. Un limite di questo approccio è che non è più compatibile con l&#39;analisi completa tensore (DTI), che è la norma per molti altri studi. In alternativa, utilizzando un minor numero di medie e più direzioni di diffusione o valori b può consentire una migliore caratterizzazione mantenendo allo stesso tempo di acquisizione. Precedenti studi hanno dimostrato che l&#39;approccio 2-direzione fornisce informazioni coerenti con l&#39;approccio 19 6-direzione (DTI), ma bisogna fare attenzione a garantire le fette (e le direzioni di diffusione) sono orientate precisamente lungo e perpendicolare al cavo. Tuttavia, acquisendo molteplici valori b consente una migliore caratterizzazione e montaggio matematica della curtosi e si consiglia l&#39;uso di un unico b-value. Inoltre, la sequenza completa è stata ripetuta con una direzione codifica fase inversa che riduce gli effetti del campo magnetico artefatti di suscettibilità, e migliora la qualità complessiva dell&#39;immagine attraverso media. Infine, la risoluzione dell&#39;immagine utilizzata nel nostro protocollo prevede la netta separazione della sostanza bianca e grigia. Le immagini con risoluzione maggiore è possibile, anche se questo viene spesso a discapito dei tempi di scansione più lunghi o il potenziale di più artefatti. Miglioramenti in bobine a radiofrequenza, sequenze di impulsi, e metodi di post-processing avranno tutti l&#39;effetto di migliorare l&#39;imaging del midollo spinale in futuri adattamenti di questo metodo. Ad esempio, bobine di superficie può essere utile per una migliore qualità d&#39;immagine simile a quello osservato nei topi. 20 Queste misure hanno un&#39;alta probabilità di essere utili come biomarcatori per la diagnosi clinica e la gestione delle lesioni del midollo spinale.

La risonanza magnetica (MRI) è uno strumento non invasivo che offre una finestra sul cervello e il midollo spinale sia in salute e malattia. MRI ha rivoluzionato la diagnosi clinica, ma è anche uno strumento prezioso per le indagini di laboratorio. I modelli animali di danno neurologico o malattia forniscono una piattaforma per capire la fisiopatologia e accelerare la scoperta di terapie. In questo rapporto, dimostriamo l&#39;applicazione di risonanza magnetica per un modello murino di lesioni del midollo spinale per indagare potenziali biomarcatori di danno microstrutturale 1 utilizzando l&#39;imaging del tensore di diffusione (DTI). Il potenziale scoperta di biomarcatori di imaging aiuterà nella diagnosi e nella gestione dei pazienti con lesioni del midollo spinale. Questi marcatori sono suscettibili di svolgere un ruolo nella scoperta di terapie in modelli preclinici e consentire l&#39;osservazione o la prognosi nella loro traduzione in ambito clinico. DTI è una forma specializzata di risonanza magnetica che misura il movimento microscopica dimolecole di acqua (cioè di diffusione). DTI è particolarmente vantaggioso nel sistema nervoso dovuta alla presenza di assoni cui diffusione è sproporzionatamente veloce lungo gli assoni che perpendicolarmente ad essi, che fornisce informazioni riguardanti il ​​loro orientamento e la composizione microstrutturale. Indici scalari derivati ​​da DTI, tra una misura della diffusione complessiva all&#39;interno del tessuto, diffusività (MD), e una misura della dipendenza orientamento della diffusione media, anisotropia frazionaria (FA) 2,3, hanno visto vaste applicazioni nel caratterizzare la microstruttura del sistema nervoso in salute e di malattia 4. Questi parametri hanno rivelato caratteristiche tissutali microscopiche che sono invisibili per la maggior parte degli altri metodi MRI. I precedenti tentativi hanno dimostrato che DTI rileva i cambiamenti microstrutturali remote all&#39;interno del midollo cervicale seguente toracica SCI nei ratti 1. I cambiamenti DTI distanza dalla lesione probabilmente riflettono come l&#39;intera res midollo spinalelaghetti di lesioni, e sono potenzialmente un marker di danno secondario. Imaging midollo spinale di ratto in vivo presenta diverse sfide uniche. In particolare, il midollo spinale è influenzata dal movimento respiratorio e richiede particolare attenzione per ridurre al minimo il movimento utilizzando diversi metodi. In studi precedenti, i dispositivi di immobilizzazione rimossi movimento della colonna vertebrale durante la scansione 5. Per l&#39;imaging del midollo cervicale, utilizziamo contenzione fisica nella forma di un titolare di testa e bar orecchio, che attenua, ma non elimina il movimento causato dalla respirazione. Inoltre, utilizziamo uno schema gating respiratorio personalizzato per sincronizzare l&#39;acquisizione di immagini con il ciclo respiratorio in modo efficiente. Queste modifiche consentono la rimozione degli artefatti altrimenti causate dal moto bulk larga scala causata dalla respirazione 6. DWI è molto sensibile al movimento microscopico, incluso il flusso di CSF e la pulsazione del sangue, e queste fonti minori di movimento contamination sono anche alleviato dal regime gating respiratorio. Inoltre, il midollo spinale ha una piccola area in sezione trasversale e rappresenta solo una frazione del campo visivo. Per cervicale immagini della colonna vertebrale, in cui il midollo spinale è situato in profondità all&#39;interno del corpo dell&#39;animale, una bobina cilindrica radiofrequenza con adeguata penetrazione del segnale è necessario per immagine midollo spinale cervicale con alta risoluzione. Una riduzione del campo visivo è raggiunto dalla soppressione di volume esterno (OVS), che serve anche per cancellare o rovinare, il segnale da tessuti di fuori del midollo spinale. Questo metodo, chiamato gradienti spoiler o soppressione del volume esterno, serve anche a ridurre la contaminazione del movimento residuo animale, flusso del CSF, o pulsazione del sangue all&#39;interno di questi tessuti. La disposizione del midollo spinale può anche essere sfruttata per semplificare il protocollo di imaging. Gli assoni del midollo spinale nella materia bianca (WM) sono quasi tutti orientati parallelamente all&#39;asse principale del midollo spinale. Thnoi, mentre DWI del cervello richiede misurazioni lungo almeno 6 direzioni per garantire i risultati non dipendono dalla posizione all&#39;interno del magnete (un processo chiamato diffusione imaging del tensore), le misurazioni del midollo spinale possono essere acquisite solo lungo due direzioni parallele e perpendicolare al cavo di 7,8, in seguito denominato longitudinale e trasversale, rispettivamente. Così, la diffusività e altri parametri sono misurati lungo le direzioni 2 separatamente e permettono inferenze nella microstruttura del tessuto in salute e malattia o lesione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small animal imaging RF coil</td>
			<td style="width:117px;">Doty</td>
			<td style="width:119px;">SAIP400-H-38-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Respiratory gating system</td>
			<td style="width:117px;">SA Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MR scanner</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">Biospec 94/30 USR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diffusion imaging in the rat cervical spinal cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

Procedure adeguate per ridurre al minimo gli artefatti da movimento producono diffusione di alta qualità le immagini pesate del ratto cervicale midollo spinale. Utilizzando gating respiratorio personalizzato (figura 2), saturando segnale indesiderato dai tessuti al di fuori della colonna vertebrale (figure 3B e C), e il campo magnetico di correzione di distorsione suscettibilità produce immagini diffusione ponderato come quelli nelle figure 4 e 5. Le immagini non appropriate o non-gated porterà ad artefatti sotto forma di ghosting (Figura 3E), considerando che la corretta gating è priva di artefatti. Ispezione visiva delle immagini ponderate di diffusione attraverso i 12 fette rivela caratteristiche del midollo spinale che si riferisce alla sua microstruttura. In particolare, la diffusione più rapida nei risultati di tessuto in una maggiore perdita di segnale sulle diffusione immagini pesate, che è aggravata con maggiore ponderazione diffusione (b-value). Con ponderazione diffusione eseguita Perpendiccolare all&#39;asse del midollo spinale, materia bianca lungo la periferia del cavo appare luminoso, poiché la diffusione è lento e limitato perpendicolare assoni. Al contrario, la materia grigia all&#39;interno della regione centrale del cavo appare più scuro, dal momento che è composto di assoni e corpi cellulari che non sono tutti allineati lungo una sola direzione. In confronto, ponderazione diffusione nei risultati parallelamente nella materia bianca con un aspetto più scuro, dal momento che la diffusione è veloce lungo gli assoni, mentre la materia grigia è relativamente più luminoso. È importante notare che le immagini di diffusione separati sono ponderati visualizzata per diversi valori b, poiché le direzioni parallele e perpendicolari hanno il miglior contrasto tra materia bianca e grigia in diversi valori b. Combinando tutte le immagini di diffusione ponderato utilizzando formalismi matematici consente mappe dei parametri di diffusione da mostrare. I segnali medi della materia bianca e grigia sono tracciati rispetto diffusion fattore di ponderazione (b-value) per le direzioni parallele e perpendicolari. Questi dati quantitativi rafforza le immagini diffusione ponderati mostrate in Figura 4. In particolare, la materia bianca ha una forte dipendenza dalla direzione del coefficiente di diffusione (longitudinale o trasversale), mentre la materia grigia è meno dipendente dalla direzione. Allo stesso modo, il montaggio del segnale in ogni voxel con l&#39;equazione di rendimenti curtosi diffusione mappe quantitative dei parametri di diffusione (Figura 6B), che evidenziano la stessa dipendenza. La sostanza bianca ha un elevato grado di anisotropia sia per diffusione (AID) e misurazioni curtosi (AIK). Pertanto, la diffusione trasversale e curtosi rivelano la microstruttura sottostante del midollo spinale che è noto da studi istologici. Questi parametri di diffusione, che vengono acquisiti in tempo reale, ma animali anestetizzati, riflettono le proprietà dei tessuti microscopiche come la densità degli assoni e diametro. Alterazioni nellamisure sé causate da infortunio e malattia saranno utili per non invasivo valutare le conseguenze di lesioni e gli effetti delle terapie promettenti. Diffusione di imaging ponderata del ratto cervicale midollo spinale può quindi diventare uno strumento per gli studi preclinici di lesioni del midollo spinale e le malattie del midollo spinale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Progettazione della bobina e supporto per midollo spinale cervicale MRI Una bobina di volume quadratura personalizzato (Doty Scientific Inc) è stato utilizzato per l&#39;immagine del rachide cervicale con alta sensibilità e uniformità. Anestesia e aria medicale sono forniti dai porti di gas indicati nel cono, che si adatta comodamente intorno al naso del ratto. Gas esalato e l&#39;eccesso viene catturato dalla linea di scarico sotto leggero vuoto. La testa del topo è fissato con la barra morso collocato intorno gli incisivi e la Delic barre orecchio postodiatamente all&#39;interno del canale uditivo. Altri componenti di monitoraggio fisiologici, compreso il monitor respiratorio e sonda di temperatura non sono mostrati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig2highres.jpg" /> Figura 2: schema di gating respiratorio. Una traccia tipica respiratoria (grigio) e grilletto (rosso) dall&#39;unità gating sono mostrati schematicamente (A). Nella tipica implementazione di gating (B), un singolo trigger viene utilizzato per acquisire tutte le sezioni (linee verticali; 12 mostrata qui) a volte uniformemente distanziati nel tempo di ripetizione (TR). Se il TR supera il periodo tipica, si possono verificare varie fette durante un respiro ed essere suscettibili di movimento (rosso). Nello schema modificato (C), un sottoinsieme di fette sono acquisiti rapidamente dopo il grilletto (6 mostrata qui) seguito da un ritardo, con le altre fette acquisite dopo l&#39;attivazione successiva. Efficacemente, Il TR è identico tra i due regimi riorganizzando i ritardi all&#39;interno della sequenza. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Posizionamento fetta MRI, bande di saturazione, e il controllo del movimento Dodici sezioni assiali sono stati organizzati l&#39;immagine Scout (A) con la fetta più anteriore posizionato ad una distanza uniforme dal punto di intersezione del tronco cerebrale e del cervelletto su. Bande di saturazione (B) sono stati aggiunti per eliminare segnale indesiderato di fuori dell&#39;area di interesse. Un&#39;immagine senza ponderazione diffusione (C) e una con ponderazione diffusione (D) con il regime gating personalizzato impiegato mostrano chiaramente l&#39;anatomia del cavo ed è libero di artefatti. Con il sistema non ottimizzato gating o gating respiratorio improprio, diffusione immagini pesate mostrano artefatti (E) come una perdita<html> del segnale all&#39;interno del cavo, o più &quot;fantasmi&quot; al di fuori del cavo che successive analisi corrotto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig4highres.jpg" /> Figura 4:. Diffusione rappresentativa pesate Utilizzando le ottimizzazioni descritti nel testo, diffusione pesate alta qualità sono stati ottenuti con trasversale ponderazione diffusione applicata (A) e longitudinali (B) all&#39;asse principale midollo spinale. Diversi valori b sono indicati per ogni direzione che forniscono il miglior contrasto tra la materia bianca e grigia a scopo illustrativo. Per ogni direzione o valore-b, tutti i 12 fette sono stati acquisiti in circa 90 sec.<html> Carico / 52390 / 52390fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig5highres.jpg" /> Figura 5:. Reversed processo di correzione di fase-encode La colonna di sinistra mostra una sola fetta ripreso con la sequenza DWI come indicato in questo protocollo (&quot;blip up&quot; immagine). La colonna centrale mostra la sequenza acquisito una seconda volta con il &quot;reverse blips&quot; impostato su &#39;on&#39;. Si noti come le caratteristiche che appaiono estendeva nella prima immagine appaiono compressi nella colonna centrale. La colonna di destra mostra le immagini di diffusione ponderato corrette utilizzando topup. La riga superiore è la non-diffusione dell&#39;immagine pesata, la fila centrale è un esempio con coefficiente di diffusione applicata in direzione trasversale, e la fila inferiore è un esempio con coefficiente di diffusione applicato nella direzione longitudinale.//www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Mappe di diffusività e curtosi computerizzata Il segnale normalizzato (intensità dell&#39;immagine) viene tracciato (A) in funzione del coefficiente di diffusione (b-value) per il trasversale (T) e longitudinale (L) diffusione direzione della codifica. Mappe di alta qualità (B) di diffusività (D), curtosi (K), e anisotropia (AI) sono calcolati dal segnale ad ogni voxel e rivelano caratteristiche uniche del tessuto del midollo spinale. In particolare, non vi è chiara differenza nei parametri tra sostanza bianca e grigia, nonché le differenze regionali nelle regioni della sostanza bianca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig6large.jpg" target="_blank">Cliccare qui a vi</a>ew una versione più grande di questa figura.

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Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusion Imaging nel midollo spinale cervicale Rat

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  Medical College of Wisconsin. The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Video: Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in Chronic Spinal Cord Compression

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic resonance imaging (MRI) plays an important role in both confirming the diagnosis and evaluating the degree of compression. However, the anatomical detail provided by conventional MRI is not sufficient to accurately estimate neuronal damage and/or assess the possibility of neuronal recovery in chronic spinal cord compression patients. In contrast, diffusion tensor imaging (DTI) can provide quantitative results according to the detection of water molecule diffusion in tissues. In the present study, we develop a methodological framework to illustrate the application of DTI in chronic spinal cord compression disease. DTI fractional anisotropy (FA), apparent diffusion coefficients (ADCs), and eigenvector values are useful for visualizing microstructural pathological changes in the spinal cord. Decreased FA and increases in ADCs and eigenvector values were observed in chronic spinal cord compression patients compared to healthy controls. DTI could help surgeons understand spinal cord injury severity and provide important information regarding prognosis and neural functional recovery. In conclusion, this protocol provides a sensitive, detailed, and noninvasive tool to evaluate spinal cord compression.

Here, we present a protocol for the application of diffusion tensor imaging parameters to evaluate spinal cord compression.

Imaging a risonanza magnetica con Tensor di diffusione nella compressione del midollo spinale cronico

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are valuable tools to understand the neural mechanisms involved in locomotor recovery after SCI and to design therapies for clinical populations. There are several experimental SCI models including contusion, compression, and transection injuries that are used in a wide variety of species. A hemisection involves the unilateral transection of the spinal cord and disrupts all ascending and descending tracts on one side only. Spinal hemisection produces a highly selective and reproducible injury in comparison to contusion or compression techniques that is useful for investigating neural plasticity in spared and damaged pathways associated with functional recovery. We present a detailed step-by-step protocol for performing a thoracic hemisection at the T8 vertebral level in the rat that results in an initial paralysis of the hindlimb on the side of the lesion with graded spontaneous recovery of locomotor function over several weeks. We also provide a locomotor scoring protocol to assess functional recovery in the open-field. The locomotor assessment provides a linear recovery profile and can be performed both early and repeatedly after injury in order to accurately screen animals for appropriate time points in which to conduct more specialized behavioral testing. The hemisection technique presented can be readily adapted to other transection models and species, and the locomotor assessment can be used in a variety of SCI and other injury models to score locomotor function.

The rat thoracic spinal hemisection is a valuable and reproducible model of unilateral spinal cord injury to investigate the neural mechanisms of locomotor recovery and treatment efficacy. This article includes a detailed step-by-step guide to perform the hemisection procedure and to assess locomotor performance in an open-field arena.

Toracico Spinal Cord Emisezione Chirurgia e valutazione locomotoria a campo aperto nel ratto

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...