SEC-MALS è un metodo quantitativo per determinare il peso molecolare, le dimensioni e la conformazione delle macromolecole in soluzione. Può identificare oligomeri e complessi e caratterizzare campioni difficili, come glicoproteine e proteine di membrana. SEC-MALS è un metodo assoluto.
Si basa sulla fisica fondamentale, e non dipende dalla collaborazione contro gli standard molecolari, la conformazione della molecola, o il modo in cui interagiamo con il mezzo di separazione. SEC-MALS può essere applicato a molti sistemi separati da sec. Dai peptidi e piccoli polimeri alle proteine, nucleocapsidi, polisaccaridi, polimeri sintetici, particelle simili a virus e piccoli virus.
È importante verificare che il sistema e i buffer manchino delle raccomandazioni del fornitore per un basso contenuto di particolato. Consulta il rappresentante del supporto tecnico del fornitore per essere sicuro. Iniziare questa procedura con la preparazione del sistema SEC-MALS come descritto nel protocollo di testo.
Utilizzando ogni reagente di grado PLC, preparare un litro di soluzione salina tamponata da fosfato con cloruro di sodio da 50 a 100 millimolare. Filtrare il buffer a 0,1 micron utilizzando un filtro in schiuma di polietere in bottiglia o simile. Filtrare i primi da 50 a 100 millilitri di tampone in una bottiglia di scarto per eliminare il particolato dai filtri a secco.
Quindi, filtrare il resto in una bottiglia pulita e sterile che è stata precedentemente lavata con acqua filtrata e deionizzata e conservata per evitare l'ingresso di polvere. Sciacquare la colonna durante la notte a una portata di 0,5 millilitri al minuto per equilibrare la colonna nel tampone e rimuovere il particolato. Utilizzare la modalità di flusso continuo dell'FPLC e assicurarsi che il flusso non si fermi fino al completamento di tutte le esecuzioni SEC-MALS.
Posizionare la cella di flusso DRI in modalità di spurgo durante lo scarico notturno. All'inizio dello scarico, aumentare gradualmente la portata per evitare che l'effetto di spargimento delle colonne, causato da un improvviso cambiamento di pressione nella colonna. Disattivare l'eliminazione prima di iniziare l'esecuzione dell'esempio.
Controllare la pulizia del sistema toccando leggermente i tubi a valle della colonna per rilasciare particelle accumulate. Osservare il segnale nel rilevatore di 90 gradi sul display del pannello frontale dello strumento MALS. Verificare che il rumore da picco a picco non sia superiore a 50-100 microvolt.
Verificare inoltre che l'indice di rifrazione, o segnale RI, sia stabile a meno di 1 per dieci fino alle meno sette unità di indice di rifrazione. Eseguire un'iniezione vuota per verificare che l'iniettore sia pulito dalle particelle. Un vuoto è semplicemente il tampone di corsa preparato in una fiala fresca e sterile.
Se il picco di particelle non è superiore a un millilitro in volume e non più di cinque millivolt sopra la linea di base, il sistema è pronto per i campioni. In caso contrario, eseguire ulteriori iniezioni vuote fino a quando non è pulito o eseguire la manutenzione per pulire l'iniettore. Ora, preparare almeno 200 microlitri di BSA a uno o due milligrammi per millilitro nel buffer SCC.
Filtrare la proteina a 02 micron, utilizzando un filtro a punta di siringa. Scartare le prime gocce di filtrato, al fine di eliminare le particelle dai filtri a secco. In alternativa, centrifugare il campione a 10.000 volte G per quindici minuti per consentire la precipitazione di aggregati non solubili e altre particelle di grandi dimensioni.
Quindi, iniettare 100 microlitri della soluzione BSA nel loop. Aprire un nuovo esperimento dal metodo nel menu software MALS. Quindi, selezionare il metodo online dalla cartella dei metodi del sistema di diffusione della luce.
Se è presente un rilevatore DLS, selezionare il metodo online dalla diffusione della luce con la cartella QELS. Impostare i parametri dell'esempio e della fase mobile nella sezione di configurazione. Nella vista pompa generica, impostare la portata su quella utilizzata nell'FPLC.
Quindi, passare alla visualizzazione pompa generica, al ramo del solvente, al campo nome e selezionare PBS. Nella vista iniettore, ramo di esempio, immettere il nome BSA. Impostare dn/dc su 0,185, A2 su 0 e il coefficiente di estinzione UV su 0,667 millilitri per milligrammo.
Nella sezione procedure, visualizzazione raccolta di base, selezionare il trigger della casella di controllo sull'recupero automatico. Impostare la durata dell'esecuzione su 70 minuti, in modo che i dati siano raccolti per l'intera allusione, fino a raggiungere il volume totale di permeazione della colonna SEC. Avviare l'esperimento nel software MALS facendo clic sul pulsante esegui.
Inizierà a leggere i dati dopo aver ricevuto il segnale di impulso dallo strumento FPLC tramite il rilevatore MALS. Azzerare il segnale DRI facendo clic sul pulsante zero automatico sul pannello frontale dello strumento. Lavorando nel software FPLC, passare al manuale, eseguire istruzioni manuali, impostare il contrassegno e inserire il nome della proteina e la corsa.
Passare dalla valvola di iniezione dal carico manuale all'iniezione, sotto percorso di flusso, valvola di iniezione. Includere un segnale di impulso inserendo un impulso di 0,5 secondi sotto l'impulso digitale dell'io box. Ciò attiverà la raccolta dei dati nel software MALS.
Ora, iniettare il campione nel ciclo. Fare clic su esegui nel software FPLC per avviare l'esecuzione dell'esperimento. Eseguire l'analisi passo dopo passo, nella sezione procedure del software MALS.
Verificare che i picchi appaiano approssimativamente allo stesso volume di allusione in UV, MALS e RI controllando la visualizzazione raccolta di base. Nella vista di base definire la linea di base per tutti i segnali. Nella vista picchi definire i picchi da analizzare facendo clic e trascinando il mouse.
Selezionare il 50% centrale di ogni picco. Prima selezionare il picco monomero, quindi il picco del dimero. Sotto ogni picco, verificare i valori corretti di dn/dc e coefficiente di estinzione a 280 nanometri per BSA.
Nelle procedure, visualizzazione allineamento, selezionare l'area centrale dei picchi facendo clic e trascinando il mouse. Fare clic su Allinea segnali e quindi su OK. Nelle procedure, vista di ampliamento della banda, scegliere il 50% centrale del picco monomero.
Assicurarsi che il rilevatore di indice di rifrazione sia specificato come strumento di riferimento. Quindi fare clic su esegui adattamento e applicare per abbinare i segnali di dispersione UV e luce al segnale indice di rifrazione. Ingrandire i picchi per verificare che si sovrappongano molto strettamente all'interno del 50-70% centrale e quindi fare clic su OK.
Nelle procedure, visualizzazione normalizzazione, selezionare il picco uno. Immettere 3,0 nanometri come valore RG, fare clic su normalizza e quindi su OK. Visualizzare il grafico dei risultati nella visualizzazione grafico EASI.
Selezionate massa molare dal display a discesa nella parte superiore della finestra. Usare il controllo, fare clic e trascinare per ingrandire l'area di picco. Per visualizzare i risultati finali della massa molare media del peso tabulato per i picchi di monomero e dimero, passare ai risultati di picco, ai momenti di massa molare, MW e selezionare i risultati, riepilogo del report.
La purezza è riportata sotto i risultati di picco, frazione di massa. Dal menu file, selezionare salva come metodo e salvare i dati BSA analizzati come metodo standard per le misurazioni future di tutti i tipi di proteine. I parametri di normalizzazione e di ampliamento della banda determinati per la BSA saranno riportati nell'analisi.
Di seguito sono riportate le analisi SEC-MALS di BSA, utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni dei pori di 200 Angstrom. Le tracce di cromatogramma vengono normalizzate al picco monomero e sfalsate per maggiore chiarezza. Vengono evidenziati artefatti comuni che possono essere ignorati, incluso un picco di particelle vicino all'inizio del segnale di dispersione della luce, così come picchi di sale e aria disciolta vicino al volume totale di permeazione nel segnale dell'indice di rifrazione.
Il cromatogramma presenta un'eccellente separazione monomero-dimero-trimer e il segnale di dispersione della luce mostra un segnale elevato al rumore. I valori medi di massa molare del peso monomero e del dimero mostrano un'elevata omogeneità. Ecco alcuni esempi di analisi SEC-MALS di bassa qualità.
In questo esempio, una separazione inadeguata su una colonna di esclusione dei pori di 75 Angstrom si traduce in un picco di particelle tra gli otto e i nove minuti, che non è ben separato dalle proteine. Qui, c'è un rapporto segnale/rumore inadeguato, e particelle estese adiacenti alle proteine sono evidenti nel segnale di dispersione della luce. I tasti per buoni risultati SEC-MALS sono la selezione di una colonna appropriata, la garanzia che il sistema sia calibrato con un basso rumore di dispersione della luce e il prefiltraggio o la centrifugazione dei campioni per rimuovere le particelle.
Dopo SEC-MALS, i campioni proteici possono essere ulteriormente analizzati per affinità di legame, bioliza, risonanza plasmonica superficiale, calorimetria di titolazione isotermica, forometria bioleride, termofesi su microscala o gradiente di composizione, scattering della luce multiangolo. La struttura proteica può essere determinata dalla cristallografia a raggi X, dalla miscroscopia crioeconico-elettrone o dalla NMR.
