Queste tecniche complementari valutano e misurano la permeabilità della vascucolatura tumorale utilizzando Dextran ad alto peso molecolare. Il protocollo a tessuto fisso offre una copertura tumorale più ampia, è ad alta produttività e non richiede apparecchiature di imaging multifotono. D'altra parte, il protocollo di imaging intravitale offre informazioni in tempo reale sulla cinetica, la funzione e l'interazione dinamica delle cellule nel microambiente tumorale della metastasi o TMEM.
Quindi i protocolli qui presentati consentono la misurazione diretta della permeabilità vascolare dipendente dal TMEM che è fortemente correlata con la diffusione delle cellule tumorali, quindi questi protocolli possono essere utilizzati per valutare il potenziale metastatico dei tumori. Per generare pezzi di tessuto tumorale adatti al trapianto, iniziare con l'eutanasia dei topi portanti di tumore come descritto nel protocollo di testo. Posizionare una piastra di Petri con mezzo di coltura cellulare DMEM/F12 sul ghiaccio nella cappa dei fumi.
Portare il mouse sul cappuccio dei fumi e sanificare l'addome del topo con il 70% di alcol etilico. Utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici, rimuovere i tumori e metterli nella piastra di Petri. Tagliare il tumore a piccoli pezzi, scartando eventuali porzioni necrotiche mentre sono nella piastra di Petri.
Per trapiantare i pezzi tumorali negli ospiti riceventi, anestetizzare i topi che sono stati allevati con macrofagi geneticamente ingegnerizzati e etichettati fluorescentmente come descritto nel protocollo di testo. Ridurre l'anestesia a circa il 3% di isofluorano e applicare un unguento oftalmico agli occhi del topo per evitare l'essiccazione. Rimuovere i capelli dalla quarta ghiandola mammaria del topo.
Dopo aver pulito la pelle con antisettico, utilizzare strumenti sterilizzati per fare una piccola incisione di circa due o tre millimetri appena inferiore al quarto capezzolo. Sezionare fino a quando il cuscinetto grasso mammario è esposto. Prendi un pezzo tumorale dalla piastra di Petri e ricopri una matrice extracellulare artificiale.
Trapiantare tumori sotto il quarto cuscinetto di grasso mammario. Chiudere l'incisione utilizzando adesivo cianoacrilato. Infine, aggiungere un millilitro di antibiotico enrofloxacina all'acqua potabile degli animali.
Anestetizza il mouse e inserisci un catetere a vena di coda come descritto nel protocollo di testo. Fai un'incisione longitudinale della linea mediana iniziando immediatamente superiore ai genitali e porta l'incisione fino al livello dell'aspetto superiore della quarta ghiandola mammaria. Portare l'incisione trasversale all'aspetto superiore della quarta ghiandola mammaria.
È fondamentale evitare di compromettere l'apporto di sangue a questo punto. Stabilizzare il lembo della pelle apporre un piccolo pezzo di gomma rigida che misura due per due centimetri sul lato della pelle del lembo. I tumori dovrebbero essere al centro dell'area stabilizzata dalla gomma.
Applicare una piccola pellicola di cianoacrilato sul bordo esterno del telaio della finestra di imaging su misura. Ora applicare una piccola goccia di PBS al centro del vetro di copertura. Evitare il contatto tra il cianoacrilato sul telaio della finestra e il PBS sul vetro per evitare la polimerizzazione prematura del cianoacrilato.
Asciugare il tessuto del lembo circostante con una salvietta da laboratorio. Apporre la piccola finestra di imaging sul lembo tissutale con il tumore al centro dell'apertura chiara. Trasferire il topo anestetizzato e il catetere della vena della coda allo stadio del microscopio.
Prestare estrema cautela per assicurarsi che il catetere della vena della coda non cada. A questo punto, eseguire l'imaging intravitale a lungo termine come descritto nel protocollo di testo e nella nostra precedente pubblicazione JoVE. Per un'analisi della produttività più elevata e una maggiore copertura tumorale, utilizzare l'immunofluorescenza nel tessuto fisso per valutare la permeabilità vascolare mediata da TMEM.
Per eseguire la colorazione dell'immunofluorescenza, preparare prima i campioni come descritto nel protocollo di testo, quindi eseguire il recupero dell'antigene riscaldando le sezioni immerse nel citrato vicino al punto di ebollizione per 20 minuti. Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15-20 minuti, lavare i campioni in PBS tre volte per due minuti ciascuno lavaggio. Bloccare per 60-90 minuti nel tampone di blocco, quindi incubare campioni con una miscela di ratto primario e anticorpi rapidi che prendono di mira rispettivamente l'endomucina e la tetrametillrhodamina.
Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBST per due minuti ciascuno. Incubare campioni con una miscela di anticorpi secondari dell'asino contro Rat IgG e IgG rapido, quindi lavare i campioni tre volte in PBST per due minuti ciascuno. Eseguire una colorazione DAPI di routine e montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio duro privo di glicerolo.
Conservare i campioni in un luogo buio fino alla scansione. Per ottenere risultati ottimali, scansionare le diapositive su uno scanner digitale a scorrimento intero. Per eseguire l'analisi delle immagini, acquisire 10 campi ad alta potenza per caso utilizzando qualsiasi software adatto alla patologia digitale.
Salvare i canali endomucina e TMR separatamente come TIFF. Utilizzando ImageJ, carica i file TIFF e convertili in immagini a 8 bit. Soglia le immagini a 8 bit al livello del controllo negativo e genera due immagini binarizzate che mostrano le maschere endomucina e TMR.
Dagli strumenti Binari, selezionate Riempi fori sulla maschera di endomucina. Generare l'immagine Dextran con soglia e salvarla come ROI Dextran. Inoltre, genera l'immagine di endomucina soglia e salvala come ROI vascolare e genera l'immagine dell'endomucina invertita e salvala come ROI extravascolare.
Successivamente genera il ROI extravascolare intersecato e l'immagine ROI di Dextran e salvala come ROI Dextran extravascolare. Infine salva l'intera immagine come ROI tumorale. Dividi l'area del ROI di Dextran extravascolare per l'area del ROI tumorale e moltiplica per 100 per generare l'area percentuale che il Dextran extravascolare copre nell'intero tumore.
Ripeti il processo per 10-20 campi ad alta potenza per caso e genera un Dextran extravascolare medio per ogni caso. Mostrata qui è l'immagine di una ghiandola mammaria sana e in via di sviluppo all'interno di un animale transgenico. La vascucolatura è etichettata da TMR Dextran in rosso, l'epitelio duttile mammario è etichettato dalla proteina fluorescente dendra2 in verde, e i macrofagi sono etichettati da una proteina fluorescente ciano.
Al contrario, un carcinoma duttile invasivo trapiantato con etichetta dendra2 è mostrato in un animale con macrofagi e vasi etichettati. Il tessuto polmonare sano è stato visualizzato attraverso una finestra di imaging polmonare all'interno di un topo con vascucolatura etichettata. Le metastasi polmonari sono evidenti dopo l'iniezione di cellule tumorali in un animale transgenico con macrofagi e vascuri etichettati.
Qui sono mostrati gli alambidi di un film di imaging intravitale time-lapsed di vasi neo-angiogenici con etichetta Dextran ad alto peso molecolare all'interno di un carcinoma invasivo trapiantato etichettato dendra2 del seno. La linea gialla punteggiata denota il contorno dell'area di perdita vascolare transitoria prima, durante e dopo l'evento di perdita. Una porta TMEM viene catturata nell'imaging dal vivo.
L'immunofluorescenza multicanale mostra endomucina, Dextran ad alto peso molecolare, la loro immagine unita insieme a DAPI, così come il corrispondente vaso sanguigno sogliato e maschere extravascolari di Dextran. Viene mostrata anche la corrispondente sezione sequenziale dell'immunoistochimica TMEM. Il profilo vascolare lontano da TMEM appare come un profilo vascolare non perdente, mentre il profilo vascolare associato al TMEM appare come un profilo vascolare che perde.
È molto importante evitare di tagliare i vasi sanguigni che forniscono il tumore durante l'esposizione chirurgica del tumore. La metodologia qui descritta può essere combinata con il trattamento farmacologico, lo stesso che inibisce la funzione TMEM, prevenendo la permeabilità vascolare o persino normalizzando la vascuolatura tumorale per misurarne l'impatto e l'efficacia. Con questi protocolli abbiamo precedentemente dimostrato che la chemioterapia migliora la permeabilità vascolare e la diffusione delle cellule tumorali e in realtà questi cambiamenti pro-metastatici possono essere aggirati co-somministrazione di inibitori della funzione TMEM.
