Questi protocolli consentono la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori e un'analisi speciale utilizzando campioni di tessuto congelato fresco e fissati in formalina e incorporati in paraffina per chiarire i ruoli delle cellule immunitarie nel cancro. Questa tecnica è un potente strumento che facilita la caratterizzazione simultanea di un marcatore 40 su una singola sezione di tessuto, preservando ampiamente la struttura del tessuto nei campioni. Il passo critico è l'ottimizzazione e la convalida degli anticorpi.
Il mancato completamento del passaggio può causare immagini di bassa qualità che possono compromettere il mantenimento di dati e risultati riproducibili di alta qualità. Iniziare ruotando tutti i tubi contenenti anticorpi a 10.000 x G per cinque minuti, aggiungere singoli anticorpi al tampone bloccante e mescolare bene. Non disturbare il fondo del tubo anticorpale durante il pipettaggio.
Filtrare il pannello anticorpale pre-bagnando un dispositivo filtrante centrifugo da 0,1 micrometri con 100 microlitri di tampone bloccante. Ruotare il filtro a 10.000 x G per due minuti e rimuovere il flusso del buffer di blocco con una pipetta. Quindi trasferire il pannello anticorpale in una colonna di rotazione e ruotare il filtro a 10.000 x G per due minuti.
Scartare la colonna di rotazione e utilizzare il flow-through come pannello anticorpale filtrato. Per la colorazione degli anticorpi, rimuovere il tampone bloccante dalle diapositive ribaltando ogni diapositiva su un lato e picchiettando delicatamente i bordi contro un tergicristallo. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e aggiungere da 100 a 200 microlitri di miscela principale anticorpale al tessuto.
Aggiungere vetrini di controllo positivi e negativi al lotto di colorazione e incubare i vetrini a 4 gradi Celsius durante la notte. Per configurare lo strumento, accedere al software di controllo e fare clic su Wake Up, se lo strumento è in modalità di sospensione. Fare clic su Exchange Sample per caricare una diapositiva e quindi fare clic su Continua per aprire la porta.
Metti la diapositiva nella fessura di caricamento con un campione rivolto verso l'alto e l'etichetta a destra, fai clic su Continua per chiudere la porta. Selezionare il progetto e quindi selezionare il nome della diapositiva per l'esempio caricato. Visualizzare l'immagine panoramica nel riquadro ottico dell'immagine della diapositiva per il campo visivo o la selezione FOV, fare clic sul menu Modalità e selezionare Rilevatore di elettroni secondario, quindi fare clic sul menu Modalità imaging e selezionare QC 300 micrometri.
Fare clic su Jog Stage per controllare la posizione del FOV e quindi fare clic sulle frecce per navigare e selezionare la posizione del FOV. Fare clic su Aggiungi FOV, impostare 400 micrometri per 400 micrometri come dimensione del campo e selezionare Fine come modalità di imaging e 1 millisecondo di tempo di permanenza, fare clic su Conferma. Dopo aver creato un elenco FOV, procedere alla messa a fuoco dell'immagine e regolare la stigmazione spostando il raggio in una regione del tessuto che non verrà visualizzata.
Regolare i parametri fino a ottenere un'immagine centrale chiara, fare clic su Avvia esecuzione. Le immagini acquisite verranno automaticamente caricate e archiviate nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul web. La matrice mostrata qui descrive la percentuale di diafonia derivata dalla purezza della sonda e dagli ossidi.
Qui le caselle blu indicano maggiore o uguale allo 0,5% di diafonia e le caselle trasparenti indicano meno di 0,5% di diafonia. Per i tag di massa, qui sono mostrate le sonde che hanno contribuito almeno allo 0,5% di diafonia in nessun canale, uno o due canali o più di due canali. Vengono mostrati anche canali di massa che ricevono almeno lo 0,5% di diafonia da nessuna sonda, una o due sonde o più di due sonde.
Le immagini di colorazione rappresentative in diversi tessuti come l'adenocarcinoma polmonare, il rene non neoplastico e le tonsille sono raffigurate qui. Qui viene presentata un'immagine di una sezione di tessuto tonsillare colorata con questa tecnica e visualizzata utilizzando un programma software di analisi delle immagini digitali di terze parti prima del filtraggio e della correzione. L'immagine della stessa sezione nelle stesse condizioni dopo i passaggi di filtraggio e correzione è mostrata qui.
Questo metodo genera immagini che possono essere caricate su un software di analisi delle immagini digitali di terze parti, consentendo analisi complete come la compartimentazione tissutale, la segmentazione cellulare, la co-espressione dei marcatori, nonché l'analisi dei vicini e l'analisi a distanza. Attraverso la ricerca sono disponibili metodi di imaging altamente multiplex. Costruendo diversi pannelli, i ricercatori possono studiare campioni di cancro, normali, paraneoplastici, infiammatori e infettivi.
