L'imaging intravitale ci consente di osservare le interazioni fisiologiche all'interno del microambiente tumorale. E usando questo metodo, specifici comportamenti dinamici osservati possono essere compartimentati utilizzando le caratteristiche del tessuto locale. Questo protocollo utilizza solo un segnale onnipresente privo di etichette da fibre di collagene o metaboliti autofluorescenti per segmentare la TME, riducendo così al minimo la quantità di manipolazioni per il topo.
Questo metodo è ampiamente applicabile a qualsiasi sistema intravitale in cui è richiesta la comprensione delle interazioni dinamiche relative alle strutture della matrice extracellulare o alle strutture vascolari. A dimostrare questa procedura saranno Dave Inman, specialista di ricerca senior, ed Erica Hoffmann, una studentessa laureata del laboratorio. Iniziare a preparare un vetro di copertura della finestra di imaging mammario immergendo un vetro di copertura rotondo da 1,5 12 millimetri in etanolo al 100% per 10 minuti, quindi asciugare il vetro di copertura sotto una lampada termica e fissare il vetro al telaio della finestra di imaging mammario in metallo utilizzando adesivo cianoacrilato.
Curare l'adesivo durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un tampone imbevuto di acetone per pulire la finestra di imaging mammario assemblata dell'adesivo in eccesso prima di immergere la finestra di imaging mammario in etanolo al 70% per almeno 10 minuti per aiutare con la pulizia. Dopo l'essiccazione, conservare la finestra di imaging mammario pulita in una capsula di Petri sterile.
Prima di iniziare l'intervento per l'impianto della finestra, autoclave strumenti chirurgici e sanificare le superfici con il 70% di etanolo. Preparare un tavolo igienizzato per l'intervento chirurgico con una coperta riscaldante coperta da un campo sterile. Impostare la coperta riscaldante in modo tale che la temperatura misurata in cima al campo sterile sia di 40 gradi Celsius.
Utilizzare l'illuminazione fredda ausiliaria e le lenti d'ingrandimento per la procedura chirurgica. Indossare DPI costituiti da un cappotto da laboratorio monouso sterile, maniche chirurgiche, guanti, protezione per gli occhi e maschera facciale. Quindi, rimuovere la pelliccia del topo anestetizzato alla quarta ghiandola mammaria inguinale con una crema depilatoria e risciacquare il sito chirurgico con una garza sterile imbevuta d'acqua.
Quindi preparare il sito chirurgico depilato per l'intervento chirurgico igienizzando la superficie della pelle con tre scrub alternati betadine ed etanolo. Al termine, sollevare delicatamente la pelle sopra la ghiandola mammaria numero quattro usando una pinza. Una volta che la pelle viene allontanata dalla parete del corpo, rimuovere una sezione di un millimetro dello strato dermico sulla punta della pinza con microscissori chirurgici.
Senza tagliare la ghiandola sottostante, creare un'incisione di 10 millimetri e quindi rilasciare la ghiandola mammaria dallo strato dermico con il delicato movimento della pinza. Aggiungere PBS per coprire la ghiandola esposta. Utilizzare una sutura intrecciata di seta 5-0 per creare una sutura di stringa di borsa lungo la periferia dell'apertura, quindi inserire un bordo della finestra di imaging mammario in modo che lo strato dermico si innesti nella tacca ricevente della finestra di imaging mammario.
Mentre si allunga l'epitelio all'estremità opposta della finestra di imaging mammario, spingere la finestra di imaging mammario in metallo in posizione in modo tale che lo strato dermico coinvolga completamente la tacca ricevente attorno all'intera circonferenza della finestra di imaging mammario. Quindi stringi il cordone della borsa per disegnare lo strato dermico nella tacca e lega lo strato per fissare la finestra. Applicare un antibiotico topico allo strato dermico nella finestra di imaging mammario e monitorare continuamente il mouse.
Dopo aver riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale, alloggiare la finestra di imaging mammaria impiantata separatamente sul letto morbido con un igloo posto nella gabbia e consentire al topo di recuperare per 48 ore prima dell'imaging. Per l'imaging, utilizzare un sistema ad aria forzata impostato su 30 gradi Celsius. Utilizzare un riscaldatore obiettivo aggiuntivo per evitare la deriva nella messa a fuoco Z e consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio a 30 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'imaging.
Quindi impostare una camera di riscaldamento sul palco del microscopio. Dopo aver confermato l'anestesia con il metodo del pizzicamento delle dita dei piedi, aggiungere un unguento per gli occhi al mouse. Per mantenere una corretta idratazione, iniettare 0,5 millilitri di PBS per via sottocutanea ogni due ore per tutta la durata della sessione di imaging.
Applicare un gel a base d'acqua invece di acqua all'obiettivo e pulire l'esterno del vetro della finestra di imaging mammario con un applicatore di cotone e un detergente per vetri prima di trasferire il mouse allo stadio del microscopio preriscaldato. Dopo aver posato il mouse sul palco del microscopio, premere il collare della finestra di imaging mammario in un foro di ricezione di 14 millimetri nell'inserto del palco per stabilizzare le immagini e adattare il tubo isoflurano. Quindi mettere a fuoco il campo di imaging utilizzando gli oculari del microscopio e l'illuminazione Brightfield, osservando la vascolarizzazione con il flusso sanguigno.
Controllare la stabilità del campo visivo. Se sono presenti artefatti di movimento respiratorio, applicare una leggera compressione sul retro della ghiandola con un piccolo blocco di schiuma e un pezzo di nastro adesivo simile a una cintura. Dopo l'applicazione della compressione, verificare che il flusso sanguigno sia mantenuto in tutto il campo visivo.
Una volta che il mouse è sedato e posizionato saldamente sullo stadio del microscopio invertito, iniziare a localizzare le regioni di interesse. Utilizzando una sorgente luminosa diretta alla finestra di imaging mammario, utilizzare gli oculari del microscopio per identificare potenziali aree di indagine. L'attenzione dovrebbe essere focalizzata sulla visione della vascolarizzazione e del flusso sanguigno.
Aggiungi e salva le posizioni XY nel software. Quando vengono impostati i livelli di potenza appropriati, impostare lo stack Z e osservare la comparsa di abbondanti fibre di collagene a 20-50 micrometri sotto la superficie di vetro della finestra di imaging mammario. Il collagene diventerà meno prevalente man mano che il microscopio si inserisce più in profondità nel tumore.
I vuoti nella generazione di seconda armonica o SHG rivelano la posizione delle masse tumorali. Impostare la fetta Z superiore sotto lo strato di cellule solitarie con le prime fibre di collagene appaiono a 50-100 micron. Imposta la fetta Z inferiore a 250 micrometri dove le fibre svaniscono e domina il segnale scarso.
Quindi ripetere la procedura per tutte le posizioni XY salvate. Una volta impostato l'intervallo dello stack Z, aumentare il tempo di permanenza a otto microsecondi e ottimizzare le impostazioni di potenza e del rilevatore. Ottimizza i livelli di potenza necessari per eccitare il tessuto per ogni esperimento e utilizza potenze fino a 90 milliwatt a 750 nanometri o 70 milliwatt a 890 nanometri all'apertura posteriore dell'obiettivo.
Quindi, iniziare con intervalli di 10 minuti tra i punti di raccolta per la maggior parte dei filmati di migrazione intravitale e regolare gli intervalli di tempo in base agli obiettivi sperimentali. Se si osservano segni di fototossicità come blebbing cellulare o autofluorescenza in rapido aumento e fotosbiancamento eccessivo, ridurre la potenza del laser o aumentare gli intervalli di timelapse come indicano le condizioni. Per l'imaging a vita di fluorescenza o FLIM di NADPH, avviare la scansione di anteprima e regolare la potenza del laser fino a quando la lettura del discriminatore di frazione costante o CFD è compresa tra 10 e la quinta e da 10 alla sesta.
Il superamento dei CFD oltre 10 al sesto risultato in accumulo di fotoni e scarsi risultati complessivi. Una volta impostato il livello di potenza, impostare il tempo di integrazione tra 90 e 120 secondi e avviare la raccolta FLIM per acquisire fotoni dal campo visivo per il tempo assegnato. Un tipico campo visivo all'interno di un tumore mammario privo di etichette ha dimostrato abbondanti fibre di collagene vicino alla finestra e una diminuzione dell'abbondanza più in profondità nel tumore.
L'uso della vita di fluorescenza o NADPH ha aiutato nell'identificazione della vascolarizzazione. Alcune regioni scure nelle immagini erano pieghe tumorali o il buttting up di lobi tumorali adiacenti. Per identificare la vascolarizzazione, un'immagine composita utilizzando NDPH FLIM è stata convalidata confrontando le proiezioni di intensità massima dello stack intravitale prima e dopo l'iniezione della vena di coda di destrano fluorescente.
L'analisi rappresentativa mostra la quantificazione di quattro topi e i campi visivi. Per delineare i confini delle masse tumorali prive di etichetta, è stata utilizzata l'autofluorescenza NADPH. Le immagini riportavano le firme metaboliche delle cellule e la posizione dei vasi sanguigni.
L'autofluorescenza AFD ha anche identificato i macrofagi. Con lo schema di segmentazione, il tumore senza etichetta è stato segmentato in compartimenti per il nido tumorale, lo stroma e la vascolarizzazione utilizzando solo l'autofluorescenza SHG e NADPH. Inoltre, le fibre di stroma e collagene possono anche essere classificate in regioni locali delle fibre allineate.
La cosa più importante da ricordare per questo protocollo è assicurarsi che il mouse sia adeguatamente sedato e trattenuto in modo che il campo visivo rimanga stabile per l'imaging.
