I prodotti naturali sono spesso biosintesi come una classe di composti, e non come un singolo prodotto. Il filtraggio diagnostico della frammentazione è un approccio semplice per rilevare tutti i composti strutturalmente correlati all'interno di una miscela complessa. Il filtro a frammentazione diagnostica, implementato all'interno del software MZmine, consente all'analista di esplorare set di dati di spettrometria di massa per nuovi prodotti naturali che altrimenti sarebbero mancati.
Ciò include nuovi bioprodutti e anche nuove tossine. Il filtraggio diagnostico della frammentazione, applicato alle classi di tossine che contaminano cibo e acqua, può informare le valutazioni dell'esposizione. Se applicato agli estratti microbici e vegetali, può portare alla scoperta di nuovi composti.
L'utilizzo del filtro a frammentazione diagnostica richiede la comprensione delle caratteristiche chiave della spettrometria di massa tandem che definiscono una classe chimica. Ciò significa che composti strutturalmente simili genereranno ioni caratteristici. Mi chiamo Shawn Hoogstra.
Sono un tecnico di ricerca e sviluppatore di software presso il nostro centro e darò prova della procedura. Per preparare un campione per l'analisi della microcistina, inoculare 30 millilitri di terreno sterile di crescita dei cianobatteri a circa cinque volte 10-al-quinto cellule per millilitro, in condizioni asettiche, in flaconi Erlenmeyer da 250 millilitri, monitorando la densità cellulare con un emocitometro. Dopo 26 giorni di coltura fotoautotrofica, illuminata con luce fluorescente bianca fredda utilizzando un regime di buio chiaro di 12 ore a 27 gradi Celsius, con vorticoso una volta al giorno, utilizzare carte filtranti in microfibra in vetro GF/C di 47 millilitri di diametro per separare le cellule dal mezzo di coltura mediante filtrazione sottovuoto.
Aggiungere tre millilitri di 80% di metanolo alle celle raccolte in provette da 14 millilitri e vortice e successivamente sonicare ogni tubo per 30 secondi. Dopo la sonicazione, liscivia i campioni con tre cicli consecutivi di disgelo di un'ora, meno 20 gradi Celsius e cicli di disgelo a temperatura ambiente di 15 minuti e filtra ogni estratto di cellule cianobatteri risultante attraverso singoli filtri a siringa in politetrafluoroetilene da 0,22 micrometri. Utilizzando un flusso delicato di gas azoto, asciugare gli estratti con un evaporatore a 30 gradi Celsius e conservare gli estratti asciutti a meno 20 gradi Celsius.
Per l'analisi della spettrometria di massa tandem cromatografica liquida, ricostituire il residuo essiccato da analizzare con 500 microlitri di metanolo al 90% e vortice i campioni per 30 secondi. Trasferire in una fiala di cromatografia liquida ad alta pressione ambrata. Quindi analizzare l'estratto di cianobatteri utilizzando un metodo di acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione secondo protocolli standard.
La maggior parte delle microcistina contiene un residuo ATA che produce due ioni di prodotto diagnostico in spettrometria di massa tandem, da M a Z 135.0803 e 163.1114. Per la preparazione di set di dati di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida non mirata, aprire MZmine 2 e selezionare Importazione dati grezzi"in Raw data methods"menu a discesa. Selezionare quindi i file di dati dall'analisi della microcistina e selezionare il filtro di prelievo di picco per applicare un algoritmo di baricentro fornito dal fornitore.
Per il filtro a frammentazione diagnostica, o DFF, dei file di acquisizione importati dipendenti dai dati, utilizzare il cursore per evidenziare i file di dati e aprire il menu a discesa Visualizzazione per selezionare l'opzione DFF. Nella finestra di dialogo DFF visualizzata inserire l'intervallo di tempi e minuti di ritenzione in cui la classe di aaliti di destinazione eluterà e trovare l'intervallo di rapporto massa-carica della classe di aaliti di destinazione, inclusa la possibilità di più composti caricati quando appropriato. Inserire la precisione di massa della spettrometria di massa tandem raggiungibile dello strumento di spettrometria di massa e inserire gli ioni prodotto specifici della classe del rapporto massa-carica.
Immettere le perdite neutre specifiche della classe e definire l'intensità minima per gli ioni di prodotto diagnostici e/o le perdite neutre da considerare come percentuale del picco di base degli spettri di spettrometria di massa tandem. Selezionare quindi un percorso e un nome di file per generare i risultati e fare clic su OK" per avviare il DFF. Un plottaggio DFF apparirà al completamento della configurazione.
L'analista deve interpretare gli spettri di massa tandem di composti noti all'interno di una classe composta per identificare gli ioni prodotto e /o le perdite neutre che sono diagnostiche per l'intera classe di composti. Questo grafico DFF è stato generato a seguito dell'analisi di M.aeruginosa CPCC 300. L'asse x rappresenta questo rapporto massa-carica degli ioni precursori che soddisfaceva i criteri DFF definiti, mentre l'asse y mostra il rapporto massa-carica di tutti gli ioni prodotto all'interno degli spettri di spettrometria di massa tandem microcistins.
Per questa analisi, i criteri per il rilevamento della microcistina includevano ioni precursori all'interno del rapporto massa-carica da 400 a 1,200 e tempi di ritenzione compresi tra due e sei minuti. Ancora più importante, questi spettri di spettrometria di massa tandem contenevano entrambi rapporti massa-carica al di sopra della soglia di intensità di picco di base definita del 15%. Dei 4.116 spettri di spettrometria di massa tandem acquisiti durante l'analisi, 26 soddisfacevano i criteri DFF e sono stati rilevati nell'estratto di M.aeruginosa CPCC 300.
Le principali microcistina rilevate potrebbero essere assegnate con sicurezza come microcistina leucina arginina e acido aspartico demetilato microcistina leucina arginina. Man mano che nuovi composti vengono scoperti utilizzando il filtraggio diagnostico della frammentazione, gli organismi possono essere coltivati su larga scala per l'isolamento e la caratterizzazione dei composti da parte della NMR. Se applicato ai microcistina, il filtraggio diagnostico della frammentazione ci consente di determinare se i metodi di screening mirati tradizionali rilevano le principali tossine presenti all'interno di un campione.
