I test di attività basati su NMR forniscono un metodo efficace per identificare, valutare e convalidare gli inibitori per un determinato enzima. Sono particolarmente adatti per lo screening dei frammenti. I test NMR sono suscettibili alle concentrazioni composte più elevate richieste per gli inibitori più deboli.
Inoltre, la mancanza di enzimi reporter li rende meno inclini a falsi positivi. Usiamo i test NMR nel nostro laboratorio per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi di Trichomonas vaginalis. Entrambi gli enzimi rappresentano nuovi bersagli per i nuovi farmaci anti-trichomonal.
I test NMR sono generalmente applicabili a qualsiasi area di ricerca che coinvolge enzimi, e possono anche essere usati per studiare gli enzimi all'interno delle cellule. Gli aspetti più importanti della tecnica sono garantire che i volumi di reagente corretti siano pipettati e i componenti di reazione siano accuratamente miscelati. Per preparare il substrato e i composti di prova, aggiungere 12 microlitri di substrato a ciascuno dei quattro tubi di microfugo da 1,5 millilitri e aggiungere sei microlitri di DMSO deuterato al controllo zero minuti e tubi di controllo di 30 minuti.
Aggiungere sei microlitri del composto di prova al primo tubo sperimentale e tre microlitri del composto di prova e tre microlitri di DMSO deuterato al secondo tubo sperimentale. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio a un tubo da 15 millilitri contenente 2,59 millilitri di tampone di reazione, seguiti da 25 microlitri di soluzione enzimatica. Invertire delicatamente il tubo due volte per miscelare la soluzione del materiale di reazione e aggiungere 10 microlitri di acido cloridrico molare 1,5 a un tubo da 1,5 millilitri contenente 582 microlitri di soluzione di scorta di reazione.
Quindi, trasferire l'intero volume della soluzione del materiale di reazione e dell'acido nel tubo di controllo di zero minuti per avviare e spegnere simultaneamente la reazione di controllo di zero minuti. Aspirare e erogare il campione due volte in modo lento ma deliberato. Avviare ed eseguire le restanti tre reazioni in modo scaglionato, trasferendo immediatamente 582 microlitri della soluzione del materiale di reazione al primo tubo sperimentale e mescolando il campione due volte come appena dimostrato.
Un'attenta aspirazione e erogazione garantisce una miscelazione completa durante le fasi di iniziazione. Essere coerenti con ogni campione per garantire che la miscelazione differenziale non sia una variabile. Dopo 30 secondi, trasferire 582 microlitri di soluzione di scorta di reazione al secondo tubo sperimentale e miscelare, seguito dall'aggiunta di altri 582 microlitri di soluzione di stock di reazione al tubo di controllo di 30 minuti 30 secondi dopo aver iniziato la reazione nel secondo tubo sperimentale.
Dopo 30 minuti, aggiungere 10 microlitri di acido cloridrico 1,5 molare al primo tubo sperimentale, ripetendo la tempra a intervalli di 30 secondi per i secondi tubi sperimentali e di controllo di 30 minuti. Una volta spente tutte le reazioni, trasferire 600 microlitri di soluzione da ogni reazione ai tubi NMR. Per calcolare la conversione percentuale del substrato per gli spettri di controllo, caricare i campioni sullo spettrometro, raccogliere gli spettri NMR e sovrapporre gli spettri per i controlli zero e 30 minuti.
Ridimensionare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti in modo che corrisponda al controllo di 30 minuti e prendere nota di questa percentuale. Quindi, calcolare la conversione percentuale come 100 meno la percentuale dalla corrispondenza dei segnali del substrato. Per calcolare la conversione percentuale del substrato per le reazioni contenenti il composto di prova, sovrapporre gli spettri per il controllo di zero minuti e la prima reazione contenente il composto di prova da 500 micromolare e scalare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti in modo che corrisponda allo spettro con il composto di prova.
Si noti questa percentuale e utilizzarla per calcolare la conversione percentuale come appena dimostrato. Quindi, sovrapporre gli spettri per il controllo di zero minuti e la prima reazione contenente il composto di prova da 250 micromolari e scalare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti per abbinare lo spettro al composto di prova. Dopo aver annotato la percentuale, utilizzarla per calcolare la conversione percentuale.
Per calcolare la reazione percentuale e l'inibizione percentuale per ogni concentrazione del composto di prova, in primo luogo, calcolare la reazione percentuale come conversione percentuale del composto di prova, divisa per la conversione percentuale del controllo per 100. Quindi calcola l'inibizione percentuale come 100 meno la reazione percentuale. Per eseguire un test dello schermo del contatore del detergente, aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio e 25 microlitri di soluzione enzimatica a un tubo da 15 millilitri contenente 2,59 millilitri di tampone di reazione.
Invertire delicatamente il tubo due volte per mescolare la soluzione del materiale di reazione e aggiungere due microlitri di detersivo Triton X-100 a 20 millilitri di tampone di reazione. Quindi, aggiungere 2,59 millilitri di tampone di reazione, contenenti 0,01%Triton X-100 detergente a un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Quindi aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio e 25 microlitri di soluzione enzimatica al tubo.
Invertire delicatamente il tubo due volte per mescolare la soluzione del materiale di reazione. Quindi, determinare l'inibizione percentuale per i composti di prova da 100 micromolari e 50 micromolari come appena dimostrato. Utilizzo della soluzione del materiale di reazione senza detergente, per un set di quattro tubi e della soluzione del materiale di reazione con detergente per un secondo set di quattro tubi.
Per eseguire una diluizione del salto, trasferire 468 microlitri di tampone di reazione e 60 microlitri di ossido di deuterio in un tubo contenente 53,8 microlitri di tampone di reazione, cinque microlitri di soluzione enzimatica e 1,2 microlitri di DMSO che ha incubato per 30 minuti. Aspirare e erogare la miscela due volte in modo lento, ma deliberato. Prima di trasferire 468 microlitri di tampone di reazione e 60 microlitri di ossido di deuterio in un tubo contenente 53,8 microlitri di tampone di reazione, cinque microlitri di soluzione enzimatica e 1,2 microlitri di composto di prova che ha incubato per 30 minuti.
Mescolare la seconda reazione due volte come dimostrato. E trasferire immediatamente 588 microlitri di soluzione dal tubo di controllo DMSO di diluizione al salto a un tubo contenente 12 microlitri di substrato con miscelazione. Continuare a trasferire 588 microlitri dalla provetta di diluizione del salto, dal tubo di controllo DMSO non diluito e dalla provetta non diluita a ciascuno dei tre tubi da 1,5 millilitri, contenenti 12 microlitri di substrato per tubo con miscelazione a intervalli di 30 secondi in seguito.
Quindi attendere 30 minuti prima di spegnere le reazioni, raccogliere gli spettri NMR e calcolare l'inibizione percentuale per ogni composto come appena dimostrato. Qui vengono mostrati i risultati per testare due composti contro AgNH in un test del composto di prova iniziale usando il protone NMR come dimostrato. La reazione enzimatica è più facilmente osservabile e quantificata dalla scomparsa delle risonanze di adenosina singlet e doublet rispettivamente a 8,48 e 6,09 parti per milione.
E la comparsa di una residenza singlet adenina a 8,33 parti per milione come osservato nello spettro di controllo di 30 minuti. In questa figura, vengono mostrati i risultati per testare un composto a due concentrazioni contro AgNH in un test detergente contro-schermo usando il protone NMR come dimostrato. Si osservano solo differenze minime nelle intensità del substrato e dei segnali del prodotto utilizzando le due condizioni, indicando che l'inibizione enzimatica osservata non è un artefatto di aggregazione composta.
Si noti che le risonanze derivanti dal composto testato e dal detergente non interferiscono con le risonanze del substrato o del prodotto. I risultati per testare un composto in un saggio di diluizione del salto contro AGNH utilizzando il protone NMR come dimostrato rivelano una ridotta intensità del segnale del substrato nella reazione 20-micromolare rispetto alla reazione di 200 micromolare, indicando che l'inibizione è reversibile. Una miscelazione completa del campione durante l'inizio di ogni reazione e per le diluizioni di salto è fondamentale.
È necessaria un'aspirazione e un'erogazione attente e coerenti. I test basati su NMR possono anche essere utilizzati per misurare l'attività enzimatica in intere cellule, utilizzando una soluzione contenente cellule sospese al posto del tampone di reazione e dell'enzima. I nostri sforzi di scoperta di farmaci anti-trichomonal continuano a fare affidamento su questi test per misurare la potenza dei composti appena sintetizzati rispetto agli enzimi riboidrolasi.
Anche se viene utilizzato solo in piccole quantità, l'acido cloridrico utilizzato per placare le reazioni è pericoloso e dovrebbe essere utilizzato con i dispositivi di protezione individuale adeguati.
