This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 Trasformazione, Espressione e purificazione <ol><li> Per PAD4 trasformazione, trasformare il plasmide contenente pGEX PAD4 GST fusione in chimicamente competente E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule per l&#39;espressione di proteine ​​utilizzando la seguente procedura. Preparare chimicamente competente (cloruro di calcio) E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule secondo protocolli standard. <ol><li> Scongelare 50 ml di preparato in precedenza BL21 chimicamente competente (DE3) celle su ghiaccio e mescolare con 1 ml di plasmide pGEX contenente gene PAD4 in una provetta da 5 ml. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min, agitando delicatamente ogni 2 min. </li><li> Heat Shock cellule collocando la miscela in un bagno d&#39;acqua a 42 ° per 40 sec. Porre immediatamente la miscela di cellule-plasmide indietro su ghiaccio per 2 minuti per permettere alle cellule di recuperare. Aggiungere 1 ml di brodo LB sterile al composto e mettere in ghiaccio per 1 min. </li><li> Incubare il calore cellule scioccato a 37 ° C, agitazione a 250 rpm per 1hr. Pipettare 75 ml di cellule trasformate su una piastra di agar ampicillina resistenti e incubare a 37 ° C per 15 h. Piastra Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Raccogliere 1 colonia di (DE3) cellule BL21 dalla piastra di agar ampicillina e posto in 5 ml di LB contenente ampicillina 1x. Posto in incubatrice e agitare O / N a 37 ° C. </li><li> Trasferire i 5 ml di LB (avviamento) in 1 L di sterile LB contenente ampicillina triidrato 1x (MW 403,45 g / mol). Posizionare la crescita in un incubatore agitazione 37 ° C. Monitorare l&#39;OD 600 della crescita. Quando la crescita raggiunge un diametro esterno 600 di 0,3, muovere la crescita in 16 ° C agitazione incubatore. </li><li> Dopo aver raggiunto un OD 600 di 0,6, induce le cellule con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Consentono alle cellule siano scossi per 15 ore a 16 ° C. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 4000 xg per 20 minuti a 0 ° C. Eliminare il surnatante e conservare pellet a -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purificazione <ol><li> Risospendere il pellet contenente il PAD4 espresso in BL21 (DE3) cellule in tampone 50 mM NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119.98 g / mol), imidazolo 10 mM (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fluoruro phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Dopo sonicazione, centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Eliminare il surnatante e riporlo. Batch il surnatante con il glutatione (GSH) agarosio per 30 minuti a RT. </li><li> Scolare il surnatante dal GST perline / colonna per gravità. Lavare perline con 4 x 25 ml di 1x PBS (tampone fosfato, pH = 8.0) a temperatura ambiente. </li><li> Eluire PAD4 con 2 x 10 ml di tampone di eluizione, Tris 50 mM (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutatione (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentrato PAD4 con 100k MW cut-oprovette da centrifuga ff e centrifugare a 4000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Aliquota di proteine ​​in 200 volumi in microlitri 1,0 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparare soluzioni madre di buffer <ol><li> Pesare il cloruro di sodio (NaCl, MW 58.44 g / mol) e preparare una soluzione 2 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Tris (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparare una soluzione 2 M, pH = 8,0. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare diidrato cloruro di calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) e preparare una soluzione 500 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparare una soluzione 200 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. </li><li> Pesare ditiotreitolo (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparare una soluzione 1 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparareuna soluzione allo 0,5% di Triton X-100. </li><li> Pesare etilendiamminotetraacetico (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparare una soluzione 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- metilcumarina cloridrato (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparare una soluzione 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 test a 37 ° C <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2 e 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20° C. Questo sarà soluzione D. </li><li> Ottenere una piastra a 96 pozzetti e designare un numero di pozzi per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4). </li><li> Pipettare 160 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 160 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare a 37 ° C per 45 min. </li><li> Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l&#39;altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipetta 10 ml di soluzione di D. Incubare per 10 min a 37 ° C. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 test a temperatura ambiente <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione di 50 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 50 micron sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di Na 100 mMCl, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione D. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzetti per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4). </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione C in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l&#39;altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipette 10 ml della soluzione D. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Andamento temporale saggi a 37 ° C e RT <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C. </li><li> Ottenere 2 piastre a 96 pozzetti e pipetta 160 ml di soluzione di B in # quantità di pozzi (# di pozzi dipenderà da quanti punti di tempo). </li><li> Incubare una piastra a 96 pozzetti a 37 ° C. Incubare l&#39;altra piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente. </li><li> Semeette 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti in entrambe le piastre a 96 pozzetti e subito Pipettare 10 ml di Soluzione C nelle t = 0 min pozzi. Continuare ad aggiungere 10 ml di soluzione C in punti temporali specifici prima di aver spento tutti i pozzetti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Inibizione test a temperatura ambiente <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 83 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 83 mM sarà Soluzione A. </li><li> Pesare Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparare una soluzione madre a 100 micron. Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thè sarà Soluzione D. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà Soluzione E. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzi per i controlli (non PAD4), pozzi di prova (+ PAD4), e pozzi di inibizione (PAD4 + Cl-ammidinici). </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione C in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di D nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione B nei pozzetti di inibizione e incubare per 20 minuti a Rte. </li><li> Pipettare 15 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione E a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 7. greggio lisato Assaya RT <ol><li> Dopo la raccolta delle cellule dal PAD4 1 L di crescita, risospendere le cellule in 10 ml di 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0. </li><li> Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Concentrare il surnatante limpido per la metà del volume mediante centrifugazione a 4000 rpm a 4 ° C con 100k MW provette di cut-off. </li><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 250 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 250 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, e 2 TCEP mM (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti nero e designmangiato pozzetti per i controlli (senza lisato cellulare) e le fonti di prova (+ lisato cellulare). </li><li> Pipettare 100 ml di soluzione B in tutti i pozzetti e le pipette 60 ml di lisato cellulare nei pozzetti di prova. Incubare per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione C a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura sul lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol>

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Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Un gran numero di proteine ​​di mammifero sono fortemente modificato dall&#39;azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine ​​del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine ​​1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine ​​può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell&#39;espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine ​​umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti 4. Istoni sono una famiglia di proteine ​​strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) 5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination 8. Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. 9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine ​​cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l&#39;unico membro di questa famiglia di proteine ​​note per essere localizzato all&#39;interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare 11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete 14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l&#39;attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine ​​istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l&#39;incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche 15,16. Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l&#39;espressione aberrante di PAD4 è associato con l&#39;insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e 17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide 18. Analogamente, l&#39;attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell&#39;ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei 19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l&#39;oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina 22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico 17,24,25. Come una prova di principio studio, l&#39;esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l&#39;apoptosi e arresto del ciclo cellulare 26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi 27. Piuttosto notevole, l&#39;inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l&#39;uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate. L&#39;uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti 28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina 27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l&#39;attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica 31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test 32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina 33, e coppia l&#39;attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo 34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare 32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l&#39;attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Inizialmente, è stato dimostrato che ZRcoum può riferire sull&#39;attività di PAD4 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Wells sono stati incubati con il substrato ZRcoum e in presenza / assenza di PAD4. Dopo un periodo di incubazione di 45 min a 37 ° C, la fluorescenza è stata misurata con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Come previsto, i livelli di fluorescenza sono rimasti bassi come fluoroforo entro ZRcoum (o il citrullinato <strong...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K Views.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and biochemically verified was opsin, the apoprotein of the photoreceptor rhodopsin. Rhodopsin is a G protein-coupled receptor localized in rod photoreceptor disc membranes of the retina where it is responsible for the perception of light. Rhodopsin&#39;s scramblase activity does not depend on its ligand 11-cis-retinal, i.e., the apoprotein opsin is also active as a scramblase. Although constitutive and regulated phospholipid scrambling play an important role in cell physiology, only a few phospholipid scramblases have been identified so far besides opsin. Here we describe a fluorescence-based assay of opsin&#39;s scramblase activity. Opsin is reconstituted into large unilamellar liposomes composed of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and a trace quantity of fluorescent NBD-labeled PC (1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine). Scramblase activity is determined by measuring the extent to which NBD-PC molecules located in the inner leaflet of the vesicle are able to access the outer leaflet where their fluorescence is chemically eliminated by a reducing agent that cannot cross the membrane. The methods we describe have general applicability and can be used to identify and characterize scramblase activities of other membrane proteins.

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Ricerca

Biochimica

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Studio dei ligandi del recettore attivati dalla proteasi nelle cellule endoteliali

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding dyes and imaging instruments that can measure fluorescent emissions from up to 1,536 wells simultaneously. However, these instruments are much more expensive and can be challenging to maintain relative to widely available plate readers that scan wells individually. Described here is an optimized plate reader assay for use with an endothelial cell line (EA.hy926) to measure the protease-activated receptor (PAR)-driven activation of G&#945;q signaling and subsequent calcium mobilization using the calcium-binding dye Fluo-4. This assay has been used to characterize a range of PAR ligands, including the allosteric PAR1-targeting anti-inflammatory "parmodulin" ligands identified in the Dockendorff lab. This protocol obviates the need for an automated liquid handler and permits the medium-throughput screening of PAR ligands in 96-well plates and should be applicable to the study of other receptors that initiate calcium mobilization.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Sviluppo di parmoduline per colpire i recettori attivati dalla proteasi per il controllo dell'infiammazione

An improved protocol for a calcium mobilization assay with endothelial cells, used to identify ligands of protease-activated receptors (PARs), has been developed. The new protocol reduces total assay time by 90-120 min and yields reproducible concentration-response curves.

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Biologia

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Neuroscienze

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico