Questo protocollo ci permette di monitorare la dinamica di interazione e la risoluzione della giunzione di Holliday con endonucleasi flap 1 a livello di singola molecola e altri sistemi enzimatici. Beh, alcuni avranno una media in tutta la popolazione molecolare o metteranno in sicurezza i singoli passi meccanicistici sottostanti e c'è. I metodi a singola molecola forniscono questi dettagli monitorando il comportamento in tempo reale delle singole molecole.
I metodi a singola molecola possono rilevare in modo efficiente le interazioni biomolecolari nell'intervallo pico e nanomolare con alta specificità. Il che è utile per molte soluzioni pratiche nella diagnostica, nel sequenziamento del genoma e nel rilevamento. I metodi ottici e forzati di misurazione a singola molecola sono ampiamente applicati in Fisica, Chimica e Biologia e hanno dimostrato di fornire osservazioni nobili che sono inaccessibili con altri metodi.
Il mio consiglio agli utenti per la prima volta è di seguire da vicino i passaggi dettagliati stabiliti in questo protocollo. Le illustrazioni visive della procedura pratica di questo protocollo porteranno a un'implementazione riuscita della tecnica. Per preparare la cella di flusso a canale singolo, iniziare forando due fori di 1,22 millimetri di diametro nella parte centrale di uno scivolo di quarzo di 50 per 20 millimetri con i centri distanti 37 millimetri e a 6,5 millimetri dal bordo dello scivolo.
Utilizzare una fresa elettronica per tagliare un canale di 41 per 2,25 millimetri in un pezzo da 50 per 20 millimetri di un doppio foglio adesivo e staccare il lato plastico del coperchio protettivo. Allineare i bordi del pezzo con i bordi dello scivolo di quarzo e utilizzare un paio di pinzette in politetrafluoroetilene per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria intrappolate. Staccare il lato carta del pezzo adesivo e montare il pezzo sulla superficie funzionalizzata di uno scivolo di copertura.
Successivamente, tagliare un pezzo di tubi in polietilene con un diametro interno di 1,22 millimetri a una lunghezza di 11 centimetri per l'ingresso e un pezzo di tubo a 25 centimetri per l'uscita. Quindi inserire i tubi nei fori precedentemente praticati come tubi di ingresso e di uscita per la cella di flusso. E utilizzare colla epossidica di cinque minuti per sigillare i bordi dell'interfaccia di scorrimento della copertura al quarzo nei tubi di ingresso e di uscita.
Quando la cellula si è asciugata, utilizzare una siringa da 1 millimetro per sciacquare 0,2 micrometri filtrati di 0,03 milligrammi per avidina di concentrazione millilitro in PBS nella cella utilizzando una seconda siringa riempita di tampone da sola per lavare eventuali avidin in eccesso alla fine della profusione. Per eseguire un esperimento FRET monocolore, applicare prima una goccia di olio ad immersione su un obiettivo di fluorescenza di riflessione interna totale 100 volte superiore e impostare la moltiplicazione su chip dei fotoeletroni su un guadagno adatto per ottimizzare il segnale sullo sfondo e prevenire la saturazione. Posizionare con cura la cella di flusso sul supporto del campione e utilizzare la regolazione del corso per aumentare gradualmente l'obiettivo fino a quando l'olio non tocca lo scivolamento del coperchio.
Accendere il laser da 532 nanometri e passare alla modalità di regolazione fine dell'obiettivo. Dirigere l'emissione sulla porta della telecamera per osservare l'immagine sul monitor e regolare l'altezza dell'obiettivo fino a quando la superficie funzionalizzata dello slittamento del coperchio non viene messa a fuoco e può essere osservata sul monitor. Verificare che lo sfondo della superficie funzionalizzata del coperchio scivoli non superi pochi punti prima di fluire nell'HJ con etichetta fluorescente. Quando il sistema è pronto a 0,2-0,5 microlitri del substrato diluito di interesse in 120 microlitri di tampone di imaging con sistema di scavenging dell'ossigeno in un tubo da 0,5 millilitri e collegare l'uscita della cella lenta a una pompa per siringhe.
Inserire il tubo di ingresso nel tubo da 1,5 millilitri e avviare la pompa della siringa a 30-50 microlitri al minuto per ritirare la soluzione dal tubo. Immagini spesso brevemente la superficie con il laser verde per confermare una buona copertura della cellula con da 100 a 300 particelle di substrato omogeneamente distribuito e ben distanziato. Se la superficie della cella di flusso è adeguatamente coperta, sciacquare altri 120 microlitri di tampone di imaging a 30-50 microlitri al minuto per lavare via qualsiasi HJ non legato e lasciare riposare la cella di flusso per 5 minuti per consentire al sistema di scavazione dell'ossigeno di esaurire l'ossigeno disciolto.
Impostare il tempo di esposizione su circa 60 millisecondi. Il tempo di ciclo verrà impostato automaticamente dal software in base alla velocità di trasferimento dei dati. Specificate il numero desiderato di cicli o fotogrammi a circa 400.
L'emissione del donatore e dei fluorofori accettori viene suddivisa in canali di colore da un dispositivo di splitter dell'immagine. Selezionate un'area adatta sulla superficie, regolate l'altezza dell'obiettivo per mettere a fuoco l'immagine e registrare e salvate il filmato in formato tiff a 16 bit. Quindi spostati in una nuova area.
Sciacquare la cella con 120 microlitri di tampone di imaging integrati con le concentrazioni indicate di GEN1 a una portata di 30 microlitri al minuto, una concentrazione alla volta. Nella risoluzione dell'esperimento di scissione HJ, regolare la portata a 110 microlitri al minuto e iniziare la registrazione da 5 a 10 secondi prima dell'ingresso dell'enzima nella cella di flusso. l'imaging per iniziare da 5 a 10 secondi prima dell'ingresso dell'enzima nella cella di flusso massimizzerà il numero di eventi.
Una volta che tutte le concentrazioni sono state testate, utilizzare una diapositiva di perline fluorescenti fissa per mappare le particelle del donatore e dell'accettore l'una all'altra nel dispositivo di divisione dell'immagine. Dopo aver installato il pacchetto software appropriato per generare una matrice di trasformazione, aprire il filmato di scorrimento del tallone registrato e selezionare le posizioni delle singole perline nei canali donatore e accettore. Una volta generata la matrice dalla diapositiva di perline fisse, fare clic su Carica TFORM e selezionare il file della matrice di trasformazione.
Nel menu a discesa filtro canale fare clic sull'opzione D&A per selezionare le particelle etichettate sia con il donatore che con l'accettore. Quindi, immettere plotTimetraceCW come indicato nel manuale per generare le tracce di tempo per ogni molecola. Per eseguire un esperimento ALEX FRET, registrare un film composto da fotogrammi consecutivi di emissioni di donatori e accettori tramite eccitazioni dirette con i laser verdi e rossi.
Aprire i filmati ALEX acquisiti e impostare la soglia di rilevamento adeguata a circa 300 per ciascuna delle emissioni del donatore a causa dell'eccitazione del donatore, dell'emissione di accettori dovuta all'eccitazione del donatore e dell'emissione di accettori a causa dei canali di eccitazione diretta. Applicare i filtri di canale appropriati per selezionare le particelle che sono state sia donatrici che accettori e collegare da 200 a 300 particelle in ciascuno dei tre canali. Utilizzate il codice PLOTHistALEX MATLAB per generare istogrammi ALEX che si adattano a picchi diversi nelle funzioni dell'istogramma e utilizzate un programma di grafiatura e analisi adatto per determinare la percentuale dell'area sotto la curva per ogni popolazione.
Quindi utilizzare il codice plotTimetraceALEX MATLAB per generare una traccia di tempo per ogni molecola che mostri l'emissione del donatore dall'eccitazione diretta nelle emissioni accettori dovute al FRET e all'eccitazione diretta. Questo istogramma FRET ad eccitazione rappresentativa dell'etichetta adiacente X-0 mostra due picchi che corrispondono all'interscambio degli isomeri più abbondanti e meno abbondanti. I tassi di isomerizzazione ottenuti dagli istogrammi del tempo di Dwell degli isomeri sono coerenti con quelli riportati in precedenza.
Gli istogrammi FRET a singola molecola della giunzione X-0 dell'etichetta adiacente a diverse concentrazioni gen1 acquisite da ALEX, rivelano un picco corrispondente all'isomero FRET alto libero e un picco corrispondente alla popolazione HJ legata dopo aver sottratto il contributo dell'isomero meno abbondante dal basso picco FRET. Ad una concentrazione di GEN1 saturante, l'istogramma FRET di X-0 ha solo un singolo picco FRET basso corrispondente a GEN1 legato a entrambi gli isomero dell'HJ come previsto dal modello. L'associazione del monomero GEN1 all'HJ seguita dalla formazione di dimeri è una caratteristica unica del resolvae HJ eucariotico GEN1 rispetto alle resolve procariotiche che esistono in forma dimerica in soluzione.
Un'ulteriore prova che il monomero GEN1 lega e distorce l'HJ è l'osservazione di un numero significativo di tracce di particelle zioaved con uno stato FRET basso stabile in presenza di magnesio a basse concentrazioni di GEN1. La partenza simultanea del donatore e dell'accettore dopo uno stato FRET basso stabile in tracce di X-0 risolto che si verifica senza l'emergere di un intermedio indica che una risoluzione completa si verifica entro la durata del complesso GEN1 HJ. Si noti che lo sfondo dalla superficie del vetro funzionalizzato non deve superare alcuni punti e che particelle distribuite uniformemente sono essenziali per ottenere buoni risultati.
Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale e una cappa aspirante durante la preparazione dell'immagine di serializzazione. Assicurati di indossare occhiali protettivi specifici per le lunghezze d'onda quando lavori con i laser. Altri metodi come crio ap, risonanza magnetica nucleare, possono fornire dettagli strutturali a livello atomico.
Queste informazioni sono parte integrante per la progettazione e l'interpretazione degli esperimenti FRET a singola molecola. La fret a singola molecola apre nuove opinioni nel campo della replicazione del DNA con conseguente comprensione più profonda dei meccanismi delle azioni elicasi e nucleasi.
