Con TRAP-seq, possiamo isolare l'RNA da specifici tipi di cellule, come gli epatociti che si ripopolano nel fegato ferito per analizzare i cambiamenti di espressione genica che si verificano in quelle cellule. Non richiede alcun passo per rimuovere le cellule indesiderate dal tessuto. L'RNA specifico del tipo cellulare è isolato dalla purificazione dell'affinità da lire di organi interi.
Questa tecnica ci aiuta a determinare come cellule specifiche rispondono alle lesioni, che potrebbero aiutare a identificare nuove strategie o farmaci per combattere le malattie del fegato. Questo potrebbe essere usato per identificare come le cellule del fegato rispondono a diversi tipi di lesioni epatiche. Attualmente, ci sono poche opzioni per gravi lesioni epatiche acute e questo metodo ci aiuterà a inorci nuovi trattamenti.
Questo metodo ha avuto origine nel cervello. Nel fegato, abbiamo immaginato che potesse essere usato per esaminare i cambiamenti dinamici in una varietà di tipi di cellule, gli epatociti, le cellule del condotto biliare, le cellule di Kupffer e le cellule endoteliali per citarne alcuni. A dimostrare la procedura sarà Amber Wang, una studentessa laureata e mia.
Per iniziare, rimospendare le perline magnetiche mediante pipettazione delicata. Raccogliere le perline su un supporto magnetico per più di un minuto e rimuovere il supernatante. Quindi, rimuovere il tubo di microcentrifugo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro di PBS, seguito da pipettare su e giù per lavare le perline.
Riposizionare il tubo sul supporto magnetico per più di un minuto per raccogliere le perline e rimuovere il PBS. Per preparare le perline ricoperte di L proteiche, aggiungere 16 microlitri di proteina biotinilata L alle perle magnetiche rimescolate e lavate e aggiungere 1X PBS per rendere il volume finale un millilitro, se si utilizza un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri, o 1,5 millilitri, se si utilizza un tubo di microcentrifugo a due millilitri. Incubare le perline magnetiche con la proteina biotinilata L per 35 minuti a temperatura ambiente su un rotatore a tubo.
Quindi, posizionare il tubo sul supporto magnetico per più di un minuto e rimuovere il supernatante per raccogliere le perline rivestite in L proteine. Rimuovere il tubo di microcentrifugo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro di PBS con tampone 3%BSA, seguito da una pipettazione delicata almeno cinque volte per lavare le perline rivestite con L proteine. Ancora una volta, posizionare il tubo sul supporto magnetico per più di un minuto e rimuovere il supernatante per raccogliere le perline rivestite.
Ripetere il lavaggio BSA altre quattro volte. Successivamente, aggiungere 50 microgrammi di anticorpi per l'anticorpo GFP 19C8 e l'anticorpo GFP 19F7 ciascuno nelle perline rivestite in L proteica e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius su un rotatore del tubo. Per raccogliere la matrice di affinità, posizionare il tubo sul supporto magnetico per più di un minuto e rimuovere il supernatante.
Togliere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro di tampone a basso contenuto di sale. Pipettare delicatamente su e giù per lavare la matrice di affinità e ripetere il tampone a basso contenuto di sale lavandone altre due volte. Rimospendare le perline in 200 microlitri di tampone a basso contenuto di sale, per realizzare 200 microlitri di matrice di affinità.
In primo luogo, impostare la smerigliatrice tissutale in modo che i tubi di vetro PTFE possano essere posizionati sul ghiaccio durante l'omogeneizzazione. Riempire quattro millilitri di tampone di lysis fredda nei tubi di vetro PTFE. Posare il fegato su una piastra di Petri.
Utilizzare un coltello per isolare da 200 a 500 milligrammi di pezzi di fegato e spostarsi nei tubi di vetro PTFE. Posizionare il tessuto epatico rimanente in un tubo di microcentrifugo pre-refrigerato e congelare il flash nell'azoto liquido. Omogeneizzare i campioni in un omogeneizzatore motorizzatore, a partire da 300 giri/min per almeno cinque colpi per dissociare gli epatociti dalla struttura epatica.
Abbassare il tubo di vetro ogni volta. Prevenire l'aerazione, che potrebbe causare denaturazione proteica, mantenendo il pestello al di sotto della soluzione. Quindi, aumentare la velocità a 900 giri/min per omogeneizzare completamente i tessuti epatici per almeno 12 colpi completi.
Trasferire il lysate in tubi etichettati e pre-refrigerati con non più di un millilitro di lysate ciascuno. Per iniziare la lisi nucleare, centrifugare il lisato epatico a 2.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo pre-refrigerato sul ghiaccio. Aggiungere 1/9 del volume supernatante del 10%NP-40 nel tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e mescolare la soluzione invertendo delicatamente il tubo.
Ruotare rapidamente i tubi a microcentrifugo con una mini centrifuga e aggiungere 1/9 del volume del campione del 10%DOC. Mescolare invertendo delicatamente i tubi di microcentrifugo e ruotare rapidamente i tubi di microcentrifugo e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare il lysate nucleare a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti e trasferire il supernatante in nuovi tubi di microcentrifugo pre-refrigerati sul ghiaccio.
Per ogni tubo, esentare l'1% del volume totale del supernatante come controllo pre-immunoprecipitazione. Posizionare i controlli di pre-immunoprecipitazione su un rotatore di tubi a quattro gradi Celsius durante la notte. Prestare particolare attenzione a rimostrare delicatamente la matrice di affinità pipettando, quindi aggiungere 200 microlitri a ciascun campione.
Incubare i lisati a quattro gradi Celsius durante la notte con una miscelazione delicata su un rotatore a tubo. Per isolare l'RNA, far girare rapidamente i tubi contenenti i lisati nella mini centrifuga e raccogliere le perline posizionando sul rack magnetico per almeno un minuto. Raccogliere il supernatante in ulteriori tubi di microcentrifugo.
Aggiungere un millilitro di tampone fresco ad alto sale ad ogni tubo, seguito da una pipettazione delicata almeno cinque volte senza introdurre bolle. Raccogliere le perline sul supporto magnetico sul ghiaccio per oltre un minuto e rimuovere il supernatante. Ripetere i passaggi di lavaggio altre quattro volte.
Quindi, rimuovere i tubi di microcentrifugo dal supporto magnetico e posizionarlo a temperatura ambiente per cinque minuti per riscaldarsi. Rimescolare le perline in 100 microlitri di tampone di lysis con 0,7 microlitri di beta-mercaptoetanolo per rilasciare RNA legato dalla matrice di affinità. Vortice i tubi per almeno cinque secondi alla massima velocità e girare rapidamente verso il basso.
Quindi, incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti. Posizionare i tubi sul supporto magnetico per almeno un minuto, quindi raccogliere il supernatante e procedere immediatamente alla pulizia dell'RNA secondo il protocollo di purificazione dell'RNA nel kit. Per ottenere la massima qualità dell'RNA isolato, eseguire tutti i passaggi opzionali, tra cui la digestione della DNasi e tutti i passaggi di eluizione dell'RNA, incluso il preriscaldamento raccomandato del buffer di eluizione a 60 gradi Celsius.
In questo studio, la fusione GFP-L10A e i transgeni Fah sono stati co-consegnati all'interno di un vettore di trappola plasmide contenente transposoni ai fegati per iniezione idrodinamica. La rimozione del nitisinone ha indotto una lesione epatica tossica. La colorazione dell'immunofluorescenza ha confermato la coespressione della proteina fusion FAH e GFP-L10A e degli epatociti ripopolanti dopo due settimane di ripopolamento epatico.
Il campione quiescente ha prodotto la più alta resa di proteine di fusione, poiché tutti gli epatociti esprimono GFP-L10A dopo iniezione AAV8-TBG-Cre. Al contrario, quasi nessun RNA era rilevabile in controlli di tipo selvaggio che non disponevano del transgene GFP-L10A, il che indica che la procedura TRAP è altamente specifica e ha uno sfondo basso. Quando trap è stato utilizzato su tessuto epatico sottoposto a ripopolamento con epatociti trasdotti GFP-L10A, è stato ottenuto un abbondante RNA di alta qualità.
Al contrario, nessuna traccia di RNA è stata rilevata tramite Bioanalyzer per il campione di controllo negativo. L'espressione di Gsta1 è stata indotta da oltre dieci volte nel ripopolare gli epatociti rispetto agli epatociti quiescenti, mentre non sono stati rilevati valori del ciclo di soglia con RNA isolato trap dal mouse di tipo selvatico a causa della mancanza di RNA di input. Quando si omogeneizza il tessuto, assicurarsi di spostare lentamente il pestello per prevenire l'aerazione.
Dopo aver isolato l'RNA, è possibile eseguire il sequenziamento ad alta velocità effettiva o il qPCR per analizzare l'espressione genica. Con TRAP-seq, ora abbiamo un metodo per isolare specificamente l'RNA dal ripopolamento degli epatociti e analizzare il cambiamento nell'espressione genica durante il ripopolamento epatico. Questo ci consente di identificare i geni che vengono alterati durante questo processo e potenziali bersagli terapeutici per il trattamento delle lesioni epatiche.
Cicloeximide e DTT, che sono presenti in diversi tamponi, sono entrambi tossici. I rifiuti dovrebbero essere raccolti e scartati secondo gli orientamenti istituzionali.
