1. Preparazione e contare le cellule Namalwa <ol><li> Rimuovere le cellule dal fiasco della cultura e centrifugare le cellule a pellet. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un volume noto di PBS. Le cellule utilizzate in questo protocollo sono cellule in sospensione. Se si utilizza cellule aderenti sarà necessario trypsinize prima del ritiro. </li><li> Per determinare il numero di cellule vive, macchia una aliquota di sospensione cellulare mescolandolo 1:1 con uno 0,4% soluzione trypan blu e seminare 10 microlitri della miscela su un vetrino di conteggio, e quindi inserire la diapositiva nella cella TC10 automatico contatore (Bio-Rad Laboratories, Inc.). </li><li> Il TC10 contatore di cellule sarà messa a fuoco automatica per garantire il conteggio più accurato, e quindi procedere con il conteggio. Si determina automaticamente la densità delle cellule vive e cellule totali nel campione. </li><li> Selezionare l&#39;immagine da visualizzare le celle del viewscreen. Quindi selezionare la calcolatrice diluizione di avere il contatore TC10 cellula calcola automaticamente la quantità di miscela di cellule che saranno necessarie. </li><li> Questo esperimento sta utilizzando un totale di tre siRNA: un siRNA di controllo e di due diversi siRNA intese a promuovere l&#39;STAT6 gene, oltre ai controlli untransfected. Ciò richiede 3,6 ml ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Inserire la concentrazione desiderata e valori volume finale nella calcolatrice di diluizione, e si calcola il volume di sospensione cellulare necessari in base alla conta delle cellule vive per quel campione. In alternativa, eseguire il calcolo manualmente. Poi trasferire il volume di miscela di cellule per questi esperimenti in un tubo nuovo. </li><li> Gira la miscela di cellule per far sedimentare le cellule e rimuovere tutti i PBS. Risospendere nel 3,6 ml di tampone Gene elettroporazione Pulser (Bio-Rad Laboratories). Trasferire 800 microlitri aliquote in provette contenenti il ​​siRNA appropriato e mescolare delicatamente. Le cellule sono ora pronti per elettroporazione. </li></ol> 2. Electroporating le cellule in piastre da 96 pozzetti <ol><li> Il 96-pozzetti elettroporazione consente la replica per tutti e quattro i trattamenti da elettroporate insieme. </li><li> Trasferire 150 ml di sospensione cellulare nei pozzetti appropriati di una piastra da 96 pozzetti elettroporazione. </li><li> Inserire la placca nella camera di elettroporazione MXcell piastra e chiudere il coperchio. </li><li> Electroporate utilizzando le impostazioni ottimizzate per la linea cellulare e del buffer utilizzato. Queste cellule sono elettroporate utilizzando un&#39;onda decadimento esponenziale con le impostazioni dello strumento di 250 V, 350 uF, la resistenza e 1000 Ω. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione è completa, pipetta su e giù delicatamente in ogni pozzetto di mescolare e poi trasferire le cellule a una piastra di coltura di tessuti contenenti pre-riscaldato media. Namalwa cellule sono coltivate in RPMI (Life Technologies) integrata con il 7,5% e 1% FCS piruvato. </li><li> I campioni di controllo che non sono stati elettroporate sono presi dalla sospensione cellulare residua e ha aggiunto ai piatti della cultura pre-riscaldato terreno di coltura in modo identico alle cellule elettroporate. </li><li> Cellule incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Dopo 24 ore, un insieme di cellule è stata indotta con 10 concentrazione ng / ml finale ricombinante IL-4 (R &amp; D Systems). Il secondo gruppo di cellule di controllo solo ricevere supporto aggiuntivo. Tutte le cellule vengono incubate ulteriori 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Estrarre e controllare l&#39;RNA <ol><li> Dopo un totale di 48 ore di crescita, contare le cellule di ogni bene, e trasferire una aliquota da ogni pozzetto in una provetta da microcentrifuga per l&#39;estrazione di RNA, e di congelare una seconda aliquota per l&#39;analisi delle proteine ​​western blotting o altro. </li><li> Centrifugare i campioni per agglomerare le cellule, e quindi rimuovere e scartare il surnatante da ogni provetta. </li><li> Procedere con l&#39;estrazione di RNA. Noi in genere utilizzano il totale Aurum RNA kit (Bio-Rad) secondo il protocollo incluso. </li><li> Durante il monitoraggio knockdown gene mediato siRNA è particolarmente importante per verificare la qualità dell&#39;RNA perché RNA degradato darà risultati fuorvianti. Il 260/280 rapporto non indica quindi l&#39;integrità dell&#39;RNA, è importante eseguire gli esempi su un gel o dispositivo a microfluidi per confermare l&#39;RNA non sono degradati. </li><li> Per valutare sia la qualità e quantità in un unico passaggio, questi campioni saranno analizzati usando il sistema automatico di elettroforesi Experion (Bio-Rad). </li><li> In primo luogo, i campioni di calore. Quindi, primo, carico, e il chip vortice Experion RNA. Inserire il chip nella stazione di elettroforesi Experion e iniziare a correre. </li><li> Dopo la corsa è completa, il software Experion mostrerà automaticamente i risultati in forma di una tabella elettroferogramma, i risultati (che mostra la concentrazione RNA ribosomiale rapporto, e il numero di RNA indicatore di qualità), e gel virtuale (che è simile a un tradizionale RNA gel). Alta qualità dei campioni di RNA totale in genere hanno un RQI di 8-10. </li&gt; </ol> 4. PCR in tempo reale <ol><li> Dopo aver verificato la qualità dell&#39;RNA, procedere con le reazioni cDNA. Questo esperimento usato il one-step RT-PCR iScript mix (Bio-Rad) di combinare la sintesi del DNA e PCR in tempo reale in una reazione. </li><li> Fai una master mix contenente tutte le componenti della reazione diversa i modelli di RNA per ogni set di primer, e distribuire tali nella piastra PCR. </li><li> Dopo diluizione dello RNA ad una concentrazione uniforme, aggiungere i campioni di RNA nei rispettivi pozzetti. Ogni reazione è impostato in triplice copia. </li><li> Sigillare la piastra, e il luogo in tempo reale CFX384 sistema PCR (Bio-Rad). Selezionare il protocollo appropriato e iniziare la corsa. </li><li> Una volta che il percorso è completo, l&#39;espressione genica è determinata confrontando l&#39;espressione genica del gene di interesse normalizzato a un gene di riferimento nelle cellule elettroporate con siRNA sperimentale per la normalizzazione delle cellule stesse elettroporate con un controllo siRNA. </li></ol> 5. Analisi dei knockdown siRNA <ol><li> L&#39;espressione di CCL17 è stato monitorato utilizzando quantitativa real-time PCR per indagare il ruolo di attivatore trascrizionale STAT6 di IL-4 induzione dipendente di CCL17. Per questo esperimento, GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento. Geni di riferimento alternativo o più geni di riferimento può essere utilizzato nello stesso modo. </li><li> Il software di gestione CFX automaticamente normalizzato CCL17 espressione di espressione del gene di riferimento dallo stesso campione e automaticamente confrontato i valori risultanti normalizzato per controllare trattamenti semplicemente selezionando GAPDH come &quot;riferimento&quot; e il trattamento di controllo (siRNA di controllo senza induzione di IL-4) come &quot;controllo&quot; nella finestra esperimento impostazioni del software di gestione CFX. </li><li> Senza induzione di IL-4, la trascrizione di CCL17 rimasto a bassi livelli di costitutiva paragonabile al trattamento di controllo. </li><li> Cellule indotte con IL-4 e mantenendo una normale STAT6 percorso (cioè, siRNA di controllo o di trattamenti di controllo untransfected) ha mostrato 8-10 volte l&#39;induzione di CCL17 espressione. </li><li> Cellule indotte con IL-4 ma con STAT6 espressione inibito dalla introduzione di entrambi i siRNA STAT6 mostrato espressione CCL17 solo di circa 2 volte maggiore rispetto alle cellule uninduced confermando il ruolo di STAT6 nelle IL-4 indotta l&#39;espressione di CCL17. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Panoramica del percorso IL-4 segnalazione. A) Il legame di IL-4 al suo recettore porta alla dimerizzazione e l&#39;attivazione di STAT6. Attivato STAT6 trasloca al nucleo e attiva la trascrizione dei suoi geni bersaglio, come il CC17. B) Senza IL-4 induzione, la trascrizione di CCL17 rimarrà a bassi livelli costitutivi. C) Dopo siRNA-mediato silenziamento del gene STAT6, il trattamento con IL4 dovrebbe portare ad aumentare poco o niente in CCL17 espressione. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. L&#39;induzione di CCL17 da IL4 misurata con diverse condizioni di tempo reale PCR quantitativa. A) I campioni coltivati ​​senza IL-4 aveva un basso livello costitutivo di espressione, indipendentemente dell&#39;espressione genica. B) Come mostrato in verde e blu, campioni di controllo normalmente risposto al trattamento con IL-4, con una induzione 8-10 volte di CCL17. Tuttavia, le cellule trasfettate con siRNA targeting STAT6, mostrati in rosso e rosa, era diminuita CCL17 espressione in risposta a IL-4, supportando l&#39;idea che STAT6 gioca un ruolo nella IL-4 indotta l&#39;espressione di CCL17.

L&#39;autore è impiegato da Bio-Rad Laboratories che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo articolo ha dimostrato come electroporate siRNA in un difficile trasfezione di linee cellulari sospensione e come seguire l&#39;espressione genica in queste cellule. Nel fare questa procedura s importante ricordarsi di mantenere le cose il più possibile coerenti in tutti i campioni.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

L&#39;uso di knockdown gene mediato siRNA continua ad essere un importante strumento in studi di espressione genica. siRNA studi sono stati condotti non solo per studiare gli effetti di downregulating singoli geni, ma anche di interrogare vie di segnalazione e di altre reti di interazioni complesse. Queste analisi percorso richiedono sia l&#39;utilizzo dei relativi modelli cellulari e metodi che causano meno perturbazione alla fisiologia cellulare. Elettroporazione viene sempre più usato come un modo efficace per introdurre siRNA e altri acidi nucleici in difficile trasfezione di linee cellulari e cellule primarie senza alterare la via di segnalazione sotto inchiesta. Ci sono diversi punti critici per un esperimento di siRNA di successo, e ci sono modi per semplificare il lavoro e di migliorare la qualità dei dati in diverse fasi sperimentali. Per aiutarvi a iniziare con il progetto mediato knockdown siRNA gene, dimostreremo come eseguire uno studio completo percorso di raccogliere e contare le cellule prima di elettroporazione attraverso trasfezione dopo analisi in tempo reale espressione genica PCR. Il seguente studio indaga il ruolo della attivatore trascrizionale STAT6 di IL-4 l&#39;espressione genica dipendente di CCL17 in una linea cellulare di linfoma di Burkitt (Namalwa). Le tecniche sono dimostrate utili per una vasta gamma di siRNA a base di esperimenti sia aderente e cellule in sospensione. Mostreremo anche come semplificare il conteggio delle cellule con il contatore TC10 cellule automatizzate, come electroporate campioni contemporaneamente utilizzando il sistema di elettroporazione MXcell, e come valutare contemporaneamente la qualità e la quantità di RNA con il sistema automatico di elettroforesi Experion.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Questa procedura descrive un flusso di lavoro rapido e facile per introdurre siRNA difficile trasfezione in linee cellulari e seguire l&#39;espressione genica mediante real-time PCR. L&#39;utilizzo di un contatore di cellule automatizzati, multi-pozzetti elettroporazione, e la stazione di elettroforesi automatizzata fornire risultati rapidi e affidabili, senza bisogno di costosi movimentazione robotica.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Research

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Biology

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell&#39;espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...