Poiché il flusso microvascolare varia tra capillari e cambiamenti nel corso del tempo di secondi, è necessario un metodo per la quantificazione continua del flusso attraverso interi campi. Il personale consente una misurazione quasi continua delle velocità di flusso su interi campi del microscopio, in poche ore, che altrimenti ci vorrebbero mesi per ottenere manualmente. Sebbene queste procedure siano semplici, la dimostrazione visiva aiuterà significativamente i nuovi utenti a navigare nel personale per la prima volta.
Per utilizzare TrakEM2 per definire la rete vascolare, selezionate Prima File, Nuovo e TrakEM2 Vuoto per impostare un nuovo progetto TrakEM2 vuoto e selezionate la nuova cartella contenente la singola immagine dal filmato come cartella del progetto. Le finestre di TrakEM2 si apriranno. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'area di lavoro principale e scegliere Importa e importa immagine.
Passare alla singola immagine salvata e selezionare l'immagine. Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse nell'area di lavoro principale e scegliere Visualizza e ridimensiona automaticamente Canvas/LayerSet. Quindi, fare clic con il pulsante sinistro del mouse nella finestra di lavoro principale.
L'immagine riempirà l'area di lavoro. Per selezionare le aree dell'immagine che contengono la rete vascolare, nella finestra TrakEM2 più piccola fare clic con il pulsante destro del mouse sul modello Qualsiasi cosa e selezionare Aggiungi nuovo elemento figlio ed elenco aree. Nella finestra TrakEM2 più piccola trascinare il modello Anything in Project Objects, progetto senza titolo.
Quindi trascinare il modello Qualsiasi cosa, elenco di area, in Oggetti progetto, progetti senza titolo, Qualsiasi cosa. In Oggetti progetto, progetto senza titolo, l'elenco dell'area Tutto sarà ora presente. Nella finestra principale di TrakEM2 sotto la scheda Spazio Z sarà stata creata una barra con etichetta Elenco aree.
Fare clic per selezionare l'elenco. Nella finestra principale di TrakEM2, selezionate lo strumento pennello e fate clic su Maiusc mentre ruotate la rotellina del mouse per selezionare una dimensione del pennello inferiore al diametro della vascuola di interesse. Premere Ctrl S per salvare il progetto.
Utilizzando lo strumento pennello, dipingi la rete vascolare, escludendo eventuali aree fuori fuoco. Al termine dell'etichettatura, fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra principale di TrakEM2 e scegliere Esporta ed elenchi di aree come etichette. Nella finestra popup selezionare Scala, 100% ed esportare tutti gli elenco di area.
Chiudere le finestre di TrakEM2 e selezionare Sì per salvare il progetto. L'immagine di Area List si aprirà e potrebbe apparire come un'immagine nera vuota. Nel menu principale delle Fiji, selezionate Immagine, Regola e Luminosità/Contrasto.
Nella finestra Luminosità e contrasto fare clic su Auto e l'elenco area diventerà visibile. Nel menu principale delle Fiji selezionare Immagine, Tabelle di ricerca e Inverti tabella di ricerca. Salvare questa immagine di etichette nere su sfondo bianco come file t-i-f e chiudere l'immagine.
Aprite il file Etichette nelle Figi e selezionate Plugin, Ossatura e Occhi ossatura. Quindi, salvate l'immagine Skeleton Eyes come file t-i-f. Per creare un nuovo progetto staff, selezionare Plugin, Macro e Apri/Crea progetto e seguire le istruzioni per creare o aggiornare un file di configurazione.
Dal menu Apri/Crea progetto passare alla cartella File di input della directory del progetto e ai file filmato e scheletro di input. Immettete i valori per la velocità massima misurata, la velocità massima mappata, la lunghezza minima del segmento, la dimensione dei pixel e la frequenza fotogrammi. Selezionare la casella correzione sfarfallio se le immagini hanno uno sfarfallio periodico dell'intensità di sfondo e fare clic su OK. Regolare i parametri per la migliore visualizzazione dei dati.
Impostare la velocità massima mappata in modo da includere circa il 95% dei dati, in modo che i dati vengono mappati nell'intera gamma della scala dei colori. Per analizzare l'ossatura, selezionate Plugin, Macro e Analizza ossatura. Il file di ossatura si aprirà e il gestore della regione di interesse si aprirà ed eseguirà.
Nel gestore area di interesse fare clic su Mostra tutto ed etichetta e quindi su OK. Per selezionare gli intervalli di tempo, selezionate Plugin, Macro e Modifica intervalli di tempo e attendete che la macro generi un cimografo da un singolo segmento nel tempo totale del filmato. Utilizzare i tasti Ctrl più e meno per aumentare le dimensioni del cimografo in base alle esigenze e utilizzare lo strumento di selezione Rettangolo per disegnare un rettangolo in ogni intervallo di tempo. Premere T o fare clic sul pulsante Aggiungi per registrare una selezione dell'intervallo di tempo e ripetere la selezione per tutti gli intervalli di tempo desiderati.
Per valutare le scelte dei parametri, selezionare da tre a quattro intervalli di tempo e completare l'analisi solo per tali intervalli. Fare clic su OK al termine della selezione dell'intervallo di tempo. Una finestra popup verrà visualizzata quando gli intervalli selezionati sono stati salvati nella cartella del progetto.
Fare clic su OK. Per analizzare il flusso, selezionare Plugin, Macro e Analizza flusso. La finestra di dialogo Analizza parametri flusso aprirà e mostrerà i valori immessi nel passaggio Apri/Crea progetto. Modificare questi valori se necessario e fare clic su OK. La finestra di dialogo Nomi file di output aprirà e mostrerà i nomi immessi nel passaggio Apri/Crea progetto.
Modificare questi nomi in base alle esigenze e fare clic su OK per iniziare l'analisi del flusso. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che indica che il flusso è stato analizzato, fare clic su OK per archiviare i risultati dell'analisi nei file di foglio di calcolo CSV. Per produrre mappe spaziali, selezionate Plugin, Macro e Produci mappa spaziale.
Verrà visualizzata la finestra Parametri mappa spaziale che visualizza i valori immessi nel passaggio Apri/Crea progetto. Modificare questi valori in base alle esigenze e fare clic su OK. Verrà generata una sequenza temporale di mappe spaziali delle velocità di flusso con ogni colore che indica una velocità di flusso. Scorrere lo stack generato di un'immagine per intervallo per visualizzare le variazioni spaziali e temporali del flusso e salvare lo stack come file a-v-i per condividere il file come filmato.
Staff Analysis genera il censimento completo delle velocità microvascolari su interi campi del microscopio, per periodi di tempo che vanno da secondi a minuti. Ad esempio, utilizzando una singola immagine in questa serie di tempo della rete microvascolare nel fegato di un mouse, l'immagine scheletrata generata è stata utilizzata per definire l'asse del flusso microvascolare, consentendo di identificare la mappa generata dal personale dei singoli segmenti vascolari per la successiva quantificazione del flusso. Dai singoli segmenti vascolari generati dall'immagine scheletrata, possono essere generati cimografi che rappresentano l'intensità lungo ogni segmento di linea nel tempo.
Gli intervalli di tempo Di ossatura e Alimentazione utente possono essere utilizzati per suddividere il cimografo di ogni segmento in intervalli di tempo di segmento individuali. Il personale identifica quindi l'angolo predominante nel kymograph da ogni intervallo di tempo del segmento e fornisce le misurazioni della velocità calcolate come file di dati CSV. L'uscita CSV del personale può essere utilizzata per analizzare la distribuzione complessiva della velocità per consentire la tracciatura della velocità nei singoli segmenti vascolari nel tempo.
E può essere visualizzato come pile di immagini mappa della velocità codificate a colori. Si noti che i risultati ottenuti dal personale dipendono dalla qualità della serie di immagini, per quanto riguarda la stabilità del campione, la frequenza dei fotogrammi, la risoluzione e il rapporto segnale/rumore. Le uscite della mappa della velocità del personale consentono un'esplorazione intuitiva della creazione di flussi spaziali, mentre gli output CSV del personale consentono l'analisi statistica delle velocità di flusso, sia all'interno che tra i gruppi di trattamento.
