Gli autori ringraziano il MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 per il supporto.

1. Semina cellulare <ol><li> Non consentono alle cellule di crescere fino a overconfluency. Utilizzare le cellule di passaggio in anticipo in cui trasfezione delle cellule primarie. </li><li> Ventiquattro ore prima della trasfezione, le cellule Tripsinizzare, contare le cellule utilizzando un emocitometro, e diluire la sospensione cellulare con supporti per ottenere la densità cellulare desiderata (cellule / volume). Cellule nel tessuto semi trasparente cultura trattata con fondo piatto da 96 pozzetti con un serbatoio e pipette multicanale. La densità scelto dovrebbe dare 70-80% di confluenza del giorno di trasfezione. Ad esempio, come mostrato nella Tabella 1, le cellule sono state diluite da 25 a 50 cellule / mL per i dati riportati qui di trasfezione. </li></ol> 2. Cella Transfection <ol><li> Diluizione di polimero e delle scorte del DNA. Scongelare polimero e soluzioni madri DNA a temperatura ambiente (RT). Diluire soluzione di polimero e stock soluzione di DNA, separatamente in chiaro piastre a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di dodici canali, Con il solvente appropriato concentrazioni necessarie per ottenere il peso di polimero desiderato rapporto peso DNA (peso / peso). In questo caso, il solvente è scelto di sodio 25 mM tampone acetato (pH = 5,2). <ol><li> DNA diluizione. Tipicamente, DNA conservati a 1 mg / ml è diluito in tampone di acetato di sodio ad una concentrazione da 0,03 a 0,06 mg / ml in un chiaro non-tessuto cultura-trattati piastra a 96 pozzetti (un pozzetto per una singola formulazione). Tabella 2 mostra il tipico protocollo di diluizione DNA per una singola formulazione usato per trasfettare quattro pozzi replicati in una piastra a 96 pozzetti seminati con cellule del punto 1. </li><li> Polimero di diluizione. La 100 mg / ml di polimero / DMSO soluzione viene diluita in tampone sodio acetato in funzione della concentrazione necessaria per ottenere il polimero di DNA desiderato peso / peso rapporto. La gamma di peso / peso rapporti tipicamente utilizzati per il trasferimento genico con poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) è di 20 a 100. Polimeri PBAE vengono prima diluito a 10 mg / ml, seguito dalla diluizioneROTOCOLLO come mostrato nella Tabella 3. Le diluizioni polimero può essere eseguita in un chiaro non-trattati coltura tissutale a 96 pozzetti che corrisponde all&#39;orientamento campione della piastra di diluizione DNA. </li></ol></li><li> Nanoparticelle formazione. Aggiungere la soluzione PBAE ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico utilizzando un dodici canali pipetta e mescolare energicamente. Lasciate che la miscela incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire l&#39;auto-assemblaggio. </li><li> Nanoparticelle trasfezione. Seguendo autoassemblaggio, 20 pl nanoparticelle sono aggiunti per pozzetto al mezzo di coltura a gocce utilizzando il dodici canali pipetta. Replica pozzi sono lasciati non trattati o sono trasfettate con i reagenti disponibili in commercio come controlli. Le cellule trasfettate sono incubate a 37 ° C per 2-4 ore e poi i pozzetti vengono sostituiti con mezzi freschi (100 pl / pozzetto). La scelta del tempo di incubazione dipende dalla linea cellulare, condizioni di coltura, e il sistema di transfezione. La differenza di trasfezioneefficienza e tossicità cellulare a causa del periodo di incubazione variabile sarà quantificato mediante il protocollo di analisi descritto nel passaggio 3. </li></ol> 3. Analisi di efficienza di trasfezione e tossicità cellulare Efficienza di trasfezione è analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando un citofluorimetro 48 ore dopo la trasfezione. Tossicità cellulare viene analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando la CellTiter 96 acquosa Un dosaggio 24 ore dopo la trasfezione. <ol><li> Microscopia a fluorescenza. Analizzare visivamente i pozzetti per l&#39;espressione del gene reporter transfettate (per esempio, EGFP o DsRed) utilizzando il canale appropriato fluorescenza. Acquisire immagini per ogni pozzetto, scegliendo campi di vista che rappresentano adeguatamente l&#39;efficienza di trasfezione per le formulazioni particolari (Figura 1). Prendere nota di qualsiasi tossicità cellulare osservata visivamente. </li><li> Citometria a flusso. <ol><li> Utilizzare pipette multicanale per preparare la piastra a 96 pozzetti per la citometria a flusso. Lavare con PBS, Tripsinizzare con 30 pl / pozzetto di tripsina / EDTA, neutralizzare con 170 microlitri tampone FACS (PBS + 2% FBS), pipetta su e giù in ciascun pozzetto, anche intorno ai bordi, e trasferire l&#39;intero 200 microlitri volume ciascun pozzetto in pozzetti in un pallone a fondo o V-bottom piastra a 96 pozzetti. </li><li> Centrifugare la piastra a 130 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere supporti 170 ul cellule da ogni bene e pipetta per risospendere evitando bolle. Per utilizzare una vitalità macchia come ioduro di propidio (PI), aggiungere 10 ml di FACS tampone + PI (50:1 FACS buffer: PI di diluizione, la concentrazione magazzino PI 1 mg / ml) in ciascun pozzetto. Porre immediatamente sul ghiaccio e coprire dalla luce. </li><li> Avviare il flusso C6 Accuri citometro, il HyperCyt 96 pozzetti attaccamento, e il software HyperView. Utilizzare Progettazione HyperView e le schede del protocollo di scegliere il p appropriataTipo di ritardo, il layout piastra, e le altre impostazioni, come shake / SIP / risciacquo / agitare tempo. Per il protocollo di cui sopra, i seguenti parametri sono stati usati, un pre-piastra prime per un minuto, e una pre-piastra agitare per 30 secondi a 2400 rpm. Tempo Sip è stato fissato per 15 sec a 15 giri al minuto, una sonda di risciacquo ogni bene per 2 secondi, e un inter-e agitare ogni 12 pozzi per 12 secondi a 2.400 giri al minuto. L&#39;inter-shake pozzo è importante per mantenere le cellule disperse nei media, nonché per migliorare la capacità di elaborare i dati includendo pause temporizzati tra gruppi di pozzetti (in questo caso 12 sec). </li><li> Utilizzare la scheda di identificazione Beh HyperView per elaborare i dati e separati nel bene appropriato (Figura 2). Al fine di identificare i singoli pozzetti, può aiutare a utilizzare il filtro del rumore del software, così come tra una base anche filtro sotto le impostazioni avanzate. </li><li> Quantificare la percentuale di cellule vive positivamente trasfettate con gating opportuno separare pop diversomentari (Figura 3). In primo luogo visualizzare i dati di flusso su un grafico a dispersione FSC e SSC, al fine di separare le cellule dai detriti (Figura 3A). Se ioduro di propidio (PI) è stato utilizzato, porta la popolazione di cellule individuale e vista che i dati su un terreno FSC vs FL3 in modo da separare le cellule vive da cellule morte e gate di cellule vive. Al fine di quantificare il numero di cellule trasfettate, vedi la popolazione cellulare diretta sui canali appropriati, per esempio, GFP può essere visto in FL1. Utilizzando la popolazione non trattata, porta le cellule non trattate per identificare il segnale di fondo (Figura 3B). Le cellule trasfettate positivamente può quindi essere isolato utilizzando questo cancello e visualizzando le popolazioni trasfettate utilizzando sia dispersione e grafici di contorno (Figura 3C e 3D). Ci può essere un continuum di cellule trasfettate positivamente, come cellule diverse saranno transfettate a diversi gradi di fluorescenza. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 acquosa Un saggio <ol><li> Transfettare un&#39;altra piastra esattamente nello stesso modo per misurazioni tossicità cellulare. </li><li> Premix 1 ml di CellTiter 96 Una soluzione acquosa di test con 10 ml supporti freschi. Rimuovere i supporti dalle cellule e utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 110 microlitri della soluzione premiscelata + supporto per pozzetto. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 490 nm ogni intervallo ore 1-4 ore finché la assorbanza dal pozzo con condizione non trattata è nel range lineare del saggio. Include quattro pozzi di controllo con i media solo + soluzione per una lettura assorbanza di fondo. </li><li> Valori medi l&#39;assorbanza delle quattro pozzi replicati per condizione e sottrarre l&#39;assorbanza di fondo media da ogni media. Normalizza la media corretta per ogni condizione trattata alla media corretta della condizione non trattata per determinare la vitalità cellulare per cento. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. nanoparticelle Sizing con NTA e plasmidi Calcoli particella per <ol><li> Primo il sistema fluidica del NS500 NanoSight eseguendo la pompa diluente in avanti a circa 1/5th la massima velocità e la pompa di campionamento indietro a circa 1/10th la velocità massima. Continuare fino a quando il sistema fluidico è lavata con diluente. </li><li> Preparare le nanoparticelle da analizzare. Nel caso di PBAEs, separatamente diluire il DNA plasmidico magazzino (1 mg / ml) e PBAE magazzino (100 mg / ml) in tampone sodio acetato (25 mM, pH 5) in provette Eppendorf. </li><li> Diluire la concentrazione di DNA plasmidico a 0,06 mg / ml. Concentrazione del polimero può variare a seconda del desiderato rapporto peso-peso di polimero DNA (ad esempio, per 60 peso / peso di particelle, polimero viene diluito a 3,6 mg / ml). </li><li> Aggiungere la soluzione di polimero ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico e mescolare vigorosamente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti per permettere l&#39;auto-assemblaggio. </li><li> Diliuto la soluzione di nanoparticelle 100 volte in PBS affinché la concentrazione nanoparticelle di essere nel range appropriato per NTA e per ottenere un volume finale di almeno 500 microlitri. </li><li> Caricare il campione nella Nanosight ponendo la provetta caricamento nel campione provetta Eppendorf (Figura 4A). Assicurarsi di non introdurre bolle d&#39;aria. </li><li> In modalità di cattura, aumentare il livello di fotocamera finché le particelle non può essere visto. Regolare il fuoco in modo che le particelle guardare liscia (Figura 4A e 4B). </li><li> In modalità standard, regolare il livello di fotocamera oltre il punto che tutte le particelle possono essere visti sullo schermo. Quindi diminuire il livello fotocamera al livello più basso in modo tale che le particelle possono ancora essere osservati. Se un livello intermedio fotocamera è necessario, andare in modalità avanzata e modificare l&#39;otturatore della fotocamera e ottenere ai livelli appropriati. </li><li> Controllare visivamente per assicurarsi che non ci sono fra 20 - 100 particelle sul screen. Un numero ideale per il monitoraggio delle nanoparticelle è di circa 50 particelle. Se ci sono troppi o troppo pochi, lavare l&#39;NS500, regolare la diluizione in PBS, e ri-caricare il campione. </li><li> Regolare la durata di acquisizione in base alla tabella delle modalità standard. Tipicamente 30 - 60 sec è una lunghezza di cattura appropriata (Figura 4B). </li><li> Per caricare il campione successivo, lavare l&#39;impianto, poi ri-caricare il nuovo campione. </li><li> Una volta che i video vengono catturati, procedere alla fase di elaborazione con l&#39;apertura di un file video. </li><li> Ci sono un certo numero di parametri che possono essere sintonizzati per elaborare meglio un video (Figura 4C). L&#39;obiettivo è quello di selezionare parametri che meglio catturare ogni particella sullo schermo, come indicato da un segno di croce rossa sullo schermo per ogni particella (Figura 5). </li><li> Aumentare il guadagno dello schermo per vedere meglio le particelle. In modalità standard o avanzata, selezionare la regolazione automatica per i parametri da clicking le caselle appropriate. Nel caso che le impostazioni auto non adeguatamente selezionare particelle, deseleziona la casella e impostare manualmente i parametri (Figura 4C). </li><li> Una volta che tutte le particelle vengono raccolte sullo schermo, fare clic sul pulsante processo del software per elaborare il file video (Figura 4C). Questo fornisce la distribuzione della dimensione delle particelle, medie dimensioni, così come la concentrazione di particelle. </li><li> Al fine di assicurarsi che la concentrazione di particelle è accurata, modificare la diluizione PBS, ad esempio aumentando la diluizione di 2x, e ripetere la procedura precedente. Misurazione diluizioni multiple dello stesso campione è raccomandata per assicurare che la misura della concentrazione del campione è accurato. Una buona gamma per la misura è 10 7 -10 9 particelle / ml. </li><li> Verificare che tutti i plasmidi sono incorporati in nanoparticelle eseguendo elettroforesi su gel delle nanoparticelle e valutare se un DNA libero è presente.Se non tutti i plasmidi sono incapsulati, utilizzare tecniche standard per misurare l&#39;assorbanza DNA per quantificare totale plasmidi incapsulati. </li><li> Per calcolare il numero medio di plasmidi per particella, dividere la concentrazione totale incapsulato plasmide dalla concentrazione di particelle misurata NTA. Per stimare il plasmide per la distribuzione di particelle campione, prima usare l&#39;istogramma delle particelle NTA dimensioni per calcolare la frazione di volume di 1-nm ciascun bin di particelle. Moltiplicate questa distribuzione frazione di volume per l&#39;importo totale plasmide per ottenere il numero di plasmidi in ogni bin. Dividere questi numeri per il numero di particelle in ciascun bin di ottenere il numero di plasmidi-per-particelle per ogni dimensione delle particelle (Figura 6). </li></ol>

<ol>
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Gli autori riportano alcun conflitto di interesse.

I protocolli sopra descrivono metodi di valutazione dell&#39;efficacia trasfezione di formulazioni di nanoparticelle, così come un modo per caratterizzare la dimensione delle particelle e caricamento DNA delle nanoparticelle. Il numero di plasmidi per particella è un parametro importante che può aiutare a prevedere l&#39;efficacia della particella e può essere utilizzato anche per la determinazione della dose. Monitoraggio analisi delle nanoparticelle può essere eseguita in una gamma di differenti soluzioni acquose...

La determinazione del numero di plasmidi complessati per nanoparticelle è importante progettare nanoparticelle efficaci strategie basate consegna del gene, in particolare per co-fornitura di plasmidi multipli al bersaglio stessa cella, come spesso è richiesto in cellule staminali riprogrammazione studi 12. Alcuni approcci per calcolare il numero di plasmidi associati a una singola nanoparticella sono stati descritti, e ogni approccio ha degli inconvenienti nelle tecniche utilizzate per la stima 13-16. Quantum dot (QD) etichettatura combinata con TEM è stato utilizzato per stimare plasmidi per particella in chitosano base di nanoparticelle. Stima con questa tecnica QD è complicato a causa della necessità di etichettare il DNA, che potrebbero alterarne le proprietà auto-assemblaggio, la possibilità che incapsulato DNA non marcato non è direttamente rilevato; plasmidi potenzialmente sovrapposti e QDs nelle immagini TEM 2D di particelle, e altre ipotesi semplificatrici 13. Un approccio alternativo, che è unApplicabile quando microdomini ordinati esistono in particelle è stato utilizzato per studiare Lipopolyamine-DNA mediante crio-microscopia elettronica a trasmissione (crio-TEM), X-ray scattering e light scattering dinamico (DLS) 14,15. Purtroppo, materiali come le nanoparticelle polimeriche esaminati qui non sono applicabili in questo metodo. . In un altro studio, Collins et al utilizzata una particella flusso tecnica di analisi di immagine per studiare (Lys) 16-peptide contenente / DNA, tuttavia, il metodo può valutare, grandi dimensioni micron particelle 16. Così, abbiamo recentemente messo a punto un nuovo metodo di analisi e flessibile per quantificare il numero di plasmidi nanoparticelle per 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone acetato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluire a 25 mM in acqua deionizzata </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DNA DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 acquose One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiale </td></tr><tr><td> Cancella fondo piatto piastra a 96 pozzetti, sterile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Cancella fondo rotondo piastra a 96 pozzetti, sterile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 canali Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 e 50-300 microlitri </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Numero di modello: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt allegato </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Non virale trasferimento genico utilizzando nanoparticelle polimeriche è emerso come un approccio interessante per la terapia genica per trattare malattie genetiche 1 e come una tecnologia per la medicina rigenerativa 2. A differenza dei virus, che hanno notevoli problemi di sicurezza, nanoparticelle polimeriche possono essere progettati per essere non tossico, non immunogenica, non mutagena, più facile da sintetizzare chimicamente versatile, in grado di trasportare più carichi di acido nucleico e biodegradabili e / o l&#39;ambiente reattivo. Polimeri cationici auto-assemblano con DNA carico negativamente tramite interazione elettrostatica per formare complessi dell&#39;ordine di 100 nm, che sono comunemente denominate nanoparticelle polimeriche. Esempi di biomateriali utilizzati per formare nanoscala policationici nanoparticelle di consegna del gene includono polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s e polietilenimmina (PEI), che è un non-degradabile off-the-shelf polimero cationico comunemente utilizzato per la consegna di acido nucleico 1,3. Poli (beta-amminoestere) s (PBAEs) sono una nuova classe di polimeri cationici 4 che sono idroliticamente degradabili 5,6 e hanno dimostrato di essere efficace nel gene delivery a hard-trasfezione tipi cellulari quali cellule endoteliali retiniche (HRECs) 7, topo cellule epiteliali mammarie 8, cervello umano cellule tumorali 9 e macrovascolari (vena ombelicale umana, HUVEC), cellule endoteliali 10. Un nuovo protocollo per caratterizzare nanoparticelle polimeriche che utilizzano l&#39;analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) è descritto. In questo approccio, sia la distribuzione della dimensione delle particelle e la distribuzione del numero di plasmidi per particella si ottengono 11. Inoltre, un elevato throughput a 96 pozzetti per saggio di transfezione piastra screening rapido dell&#39;efficacia trasfezione di nanoparticelle polimeriche è presentato. In questo protocollo, poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) sono usati come modello polimeri e cellule retiniche umane endoteliali (HRECs) sono usati come modEL cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente adattato per valutare qualsiasi nanoparticella polimerica e qualsiasi tipo di cellule in un multi-pozzetto formato lastra.

La figura 1 mostra una immagine di fluorescenza microscopia di un esempio di trasfezione successo HRECs con il plasmide EGFP. L&#39;immagine brightfield è utile per garantire che le cellule mantengono la loro morfologia normale. Inoltre, saggi di vitalità cellulare, come saggi MTS o simili, può essere utilizzato per valutare la tossicità delle nanoparticelle 7. Citometria a flusso, come descritto, può essere usato per quantificare l&#39;efficienza di trasfezione. Quando si utilizza il Hy...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocollo per l&#39;analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

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Bioengineering

15.7K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna d...

Video: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Ricerca

Bioingegneria

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...