Questo protocollo è significativo perché fornisce un approccio generale all'ingegneria dei sistemi di dimerizzazione delle proteine come biosensori per una varietà di piccole molecole. Inoltre, utilizza una libreria proteica molto diversificata per selezionare biosensori per diversi ligandi in modo efficiente ed economico senza la necessità di apparecchiature specializzate. Il biosensore ingegnerizzato può essere utilizzato per controllare chimicamente il comportamento delle cellule e per monitorare i cambiamenti in tempo reale nei metaboliti cellulari.
Attraverso questa dimostrazione visiva, i ricercatori possono osservare un'istruzione dettagliata delle tecniche con una chiara aspettativa dell'output sperimentale. Inizia ogni ciclo di selezione coltivando una singola colonia cellulare competente per l'elettroporazione TG1 in sei millilitri di mezzo 2YT a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto a un'assorbanza di 600 nanometri di circa 0,5. Una volta raggiunta la densità ottica ottimale, posizionare le cellule sul ghiaccio.
Per preparare le perline di selezione negativa, lavare 300 microlitri di perline magnetiche rivestite con streptavidina tre volte con un millilitro di 05%PBS più buffer Tween e due volte con un millilitro di PBS per lavaggio su un rack di separazione magnetica. Rimospendare le perline con un millilitro dell'1% di caseina in PBS e saturare le perline con biotina a cinque volte la capacità di legame segnalata delle perline. Dopo un'ora a temperatura ambiente con rotazione, lavare le perline cinque volte con PBS più Tween e tre volte con PBS come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere circa una volta 10 alle 13 particelle di fago nell'1% di caseina e nell'1% di albumina di siero bovino in PBS alle perline per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con rotazione. Alla fine dell'incubazione, trasferire il supernatante in un tubo da 1,5 millilitri. Per una selezione positiva con le perle di streptavidina legate al ligando biotinilato, saturare la metà del volume di perline utilizzate per la selezione negativa nel ligando biotinylato di scelta a cinque volte la piena capacità di legame calcolata secondo il manuale.
Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con rotazione, lavare le perline cinque volte con PBS più Tween e tre volte con pbs da solo come dimostrato, e bloccare le perline con un millilitro di 1%caseina e 1% di albumina di siero bovino per un'ora con rotazione. Alla fine dell'incubazione, lavare le perle magnetiche rivestite di streptavidina tre volte in PBS più Tween e una volta nel solo PBS come dimostrato, e utilizzare il fago non legato per rimoderare le perle magnetiche rivestite di streptavidina. Estrarre il supernatante contenente fago non legato senza disturbare le perline e mettere da parte il campione da utilizzare come input.
Quindi lavare le perline 10 volte con PBS più Tween e cinque volte con PBS come dimostrato, trasferendo le perline su un nuovo tubo dopo ogni tre lavaggi per evitare il legame non specifico dei fagi legati alle pareti del tubo. Per elutare in modo competitivo i fagi legati, aggiungere 450 microlitri di concentrazione micromolare di ligando non biotinilato alle perline di selezione positive e posizionare le perline a rotazione per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire il supernatante in un nuovo tubo da utilizzare come uscita.
Per la titolazione in ingresso, preparare 10 diluizioni seriali in PBS fino a una per 10 a nove volte con il fago di ingresso. Trasferire 10 microlitri di fago in ingresso da uno per 10 a sette a 10 alle nove diluizioni alle aliquote a 70 microlitri delle cellule TG1 preparate. Dopo 45 minuti a 37 gradi Celsius, placcare le cellule TG1 infette su singoli piatti di agar 2YT da 90 millimetri contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e 2% di glucosio per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, usa la formula per calcolare l'input del fago. Per l'infezione da uscita e la titolazione, aggiungere i fagi eluiti a tre millilitri di cellule TG1 per un'incubazione di 45 minuti in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi. Quindi preparare 10 diluizioni seriali delle cellule infette in mezzo 2YT fresco fino a una volta 10 alla terza concentrazione e placcare ogni diluizione su piatti di agar 2YT da 90 millimetri per la loro incubazione notturna a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, calcola l'uscita del fago in base alla formula. Per isolare i singoli cloni da una sottobiblioteca arricchita, trasferire singole colonie dalle piastre cellulari TG1 coltivate durante la notte e infettate da fago in 250 microlitri di mezzo 2YT integrati con ampicillina per pozzo in piastre sterili a pozzo profondo per la loro coltura notturna a 37 gradi Celsius. Quando le cellule raggiungono una densità di 600 nanometri di circa 0,5, aggiungere cinque volte 10 alle nove unità di formatura della placca per millilitro di fago aiutante CM13 ad ogni pozzo e incubare le cellule per 45 minuti a 37 gradi Celsius a 250 rotazioni al minuto.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo 2YT integrati con ampicillina e 50 microgrammi per millilitro di kanamicina ad ogni pozzo e posizionare la piastra a 25 gradi Celsius e 250 rotazioni al minuto durante la notte. La mattina seguente, sedimentare le cellule per centrifugazione per consentire la raccolta delle particelle di fago. Per convalidare l'attacco dell'ancora di ELISA, rivestire piastre ELISA da 96 pozzi con 100 microlitri di cinque microgrammi per millilitro streptavidina nel tampone di rivestimento a quattro gradi Celsius durante la notte.
La mattina seguente, lavare le piastre tre volte in 300 microlitri di PBS più Tween prima di aggiungere 100 microlitri di bersaglio biotinilato mono micromolare ai pozzi bersaglio e 100 microlitri di biotina un micromolare o omologo bersaglio ai pozzi di controllo appropriati. Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le piastre cinque volte con PBS più Tween per lavaggio e bloccare qualsiasi legame non specifico con 300 microlitri dell'1% di caseina per pozzo per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le piastre tre volte in PBS fresco più Tween per lavaggio e aggiungere il supernatante fago purificato.
Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le piastre 10 volte con PBS fresco più Tween per lavaggio. Aggiungere a ciascun pozzo 100 microlitri di perossidasi di rafano M13 per ogni pozzo per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare le piastre tre volte come dimostrato e aggiungere 100 microlitri di substrato TMB a ciascun pozzo per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente o fino a quando non si osserva un cambiamento di colore visibile.
Quindi interrompere la reazione con 100 microlitri di acido cloridrico molare per pozzo e leggere la piastra a 450 nanometri su uno spettrofotometro. Dopo la convalida del legante di ancoraggio, lo screening del legante di dimerizzazione deve essere eseguito anche utilizzando la stessa libreria proteica destinata al complesso legante-ligando di ancoraggio. I risultati tipici dell'arricchimento dopo quattro o sei cicli di selezione sono una buona indicazione del fatto che vi è un elevato rapporto di potenziali colpi nei sottolibrari, nel qual caso potrebbero non essere necessari ulteriori cicli di selezione.
Elisa single clone è adatto per analizzare l'affinità di legame relativa e la selettività dei raccoglitori di ancoraggio e dimerizzazione e facilita il confronto della selettività di legame tra cloni. Allo stesso modo, la selezione del legante di dimerizzazione consente l'identificazione di cloni che formano un eterodimero con il legante di ancoraggio immobilizzato solo con o senza il ligando. Questi dati di legame dipendenti dalla concentrazione del ligando suggeriscono che i nanocorpi testati sono adatti per costruire un sistema di dimerizzazione indotto chimicamente rispetto allo scarso legame dimostrato dai campioni di controllo.
Inoltre, la cromatografia analitica ad esclusione di dimensioni può essere utilizzata per confermare la formazione di eterodimeri tra leganti di ancoraggio e dimerizzazione in presenza del ligando. Ad esempio, in questo esperimento, è stato osservato un picco di dimerizzazione quando sono stati mescolati i leganti di ancoraggio e dimerizzazione e il cannabidiolo. Al contrario, non è stato rilevato alcun picco di dimerizzazione in assenza di cannabidiolo o quando ogni legante è stato caricato sulla sola colonna.
Il sistema di dimerizzazione proteica deve essere codificato geneticamente in lievito o cellule di mammifero per consentire un'ulteriore verifica dei biosensori selezionati per lo sviluppo di applicazioni in vivo. Ci aspettiamo che questo metodo dia ad altri ricercatori gli strumenti efficaci e necessari per rilevare importanti metaboliti, molecole di segnalazione o farmaci in vivo con un'alta risoluzione spaziotemporale.
