Per migliorare la comprensione del legame fattore di trascrizione-DNA, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le costanti di dissociazione su larga scala usando ad esempio misurazioni dell'anisotropia. Questa tecnica consente di ottenere automaticamente curve di titolazione complete per determinare la costante di dissociazione con alta sensibilità. Funziona in soluzione all'equilibrio, ha una produttività moderata e una vasta gamma dinamica.
È stato applicato HiP-FA per perfezionare il panorama dell'affinità di associazione dei fattori di trascrizione. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere applicato ad altri tipi di eventi vincolanti come le interazioni proteina-proteina o proteina-farmaco, per esempio. Consiglio di eseguire prima più titolazioni con gli stessi partner di legame per ottenere una stima sulla riproducibilità delle misurazioni.
Se disponibile, utilizzare un sistema automatizzato per una ridutbilità ancora migliore. Per ricotturare gli oligomeri di DNA del DNA di riferimento, mescolare sette microlitri di ogni dieci millimolare dietichettato in avanti e filamento inverso senza etichetta in un unico tubo. Per il DNA concorrente, mescolare 20 microlitri di ogni filamento non etichettato da 100 millimolari in due pozzi di una piastra PCR ben data 96.
Quindi, utilizzare una macchina PCR standard per riscaldare le soluzioni di DNA a 70 gradi Celsius per i tre minuti. Quindi, ridurre a temperatura ambiente alla velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo. Utilizzare un forno a microonde per sciogliere 0,5 grammi di agarosio in tampone leganti da 100 millilitri.
Aggiungere acqua distillata doppia per regolare il volume finale per compensare la possibile evaporazione. Preparare dieci aliquote di magazzino millilitro. Per preparare i pozzi di titolazione e taratura di una piastra di 96 pozza, trasferire due aliquote di gel stock in uno shaker dell'incubatore Celsius di 75 gradi Celsius.
Per ogni bene di titolazione, aggiungere 1,4 nanomoli di DNA di riferimento, proteina del fattore di trascrizione, ad una concentrazione finale di 20-60 nanomoli, 0,2 MTT millimolare e il tampone di legame a 240 microlitri del gel fuso. Mescolare accuratamente invertendo e scuotendo il tubo. Quindi, pipettare lentamente 200 microlitri per pozzo del gel contenente DNA nei pozzi di titolazione designati di una piastra di pozzo 96.
Per ogni pozzo di calibrazione, aggiungere 5 nanomoli nilo colorante blu a 240 microlitri del gel fuso. Evitando bolle d'aria, pipettare lentamente 200 microlitri della soluzione di gel contenente colorante in cinque o sei pozzi della piastra del pozzo 96. Posizionare il gel su una superficie perfettamente orizzontale e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente e altri 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Utilizzare un lettore di piastre multi-pozzo per verificare l'omogeneità dei livelli di altezza del gel in diversi pozzi della piastra. Per preparare la soluzione di DNA concorrente, combinare prima il DNA di riferimento etichettato, la proteina e il triplice tampone di legame concentrato. Quindi, mescolare 20 microlitri della soluzione con 40 microlitri di ciascuna delle soluzioni di DNA concorrenti ricotte.
Per ogni pozzo di taratura, combinare le quantità appropriate di una delle soluzioni di DNA della concorrente ricottura e il tre volte tampone di legame concentrato contenente 15 millimolare soluzione di colorante blu nilo. Infine, aggiungere 50 microlitri delle soluzioni miste concorrenti sopra i gel il più simultaneamente possibile. Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, posizionare la piastra del pozzo 96 sullo stadio del microscopio.
Quindi, prendi una serie di serie temporali di immagini Z-stack di pozzi fino a quando non completa disassociazione della proteina dal DNA di riferimento. Eseguire il saggio di titolazione secondo il manoscritto. Quindi utilizzare il software HiP-FA per creare curve di titolazione per singole sequenze concorrenti.
Quindi, fare clic sul pulsante di esportazione per ottenere la costante di dissociazione e la concentrazione della proteina attiva in ogni bene di titolazione. Prestare particolare attenzione quando si tubazionano le soluzioni di gel viscose. La pipettazione imprecisa può ridurre la precisione per la determinazione delle costanti di dissociazione.
In questo studio, il metodo HiP-FA viene applicato per determinare le preferenze di legame del DNA di un fattore di trascrizione con zip B. Gigante, dalla rete genica di segmentazione della mosca. L'elevata somiglianza delle PWM per le repliche preparate manualmente o utilizzando tecniche di automazione ha dimostrato l'elevata riproducibilità del metodo HiP-FA.
Le PWM ottenute con questo metodo e altri metodi sono nel complesso simili. Tuttavia, deviazioni significative possono essere viste nelle posizioni due e sette del motivo centrale in cui le mutazioni possono portare a una completa perdita di legame o a un legame molto più forte rispetto alle misurazioni precedenti. Usiamo HiP-FA per generare perfezionamenti per le associazioni di decine di fattori di trascrizione e mostra che ottiene alla fine una migliore previsione dei dati.
Crediamo che la sua misura di alta precisione possa essere molto utile per comprendere meglio il legame TF-DNA per tutto il sistema o per tutti i tipi di interazioni.
