La modifica post traslazione delle proteine da parte della piccola proteina ubiquitina è coinvolta in molti eventi nella cellula. Questo studio presenta un'aggiunta originale alla cassetta degli attrezzi per l'analisi dell'ubiquitinazione proteica. Utilizziamo tecniche di arricchimento e spettrometria di massa per scoprire l'ubiquitinoma profondo.
Abbiamo apportato diversi miglioramenti all'analisi dei peptidi digli che provengono da proteine ubiquitinate. Questi includono il frazionamento peptidico grezzo prima dell'arricchimento e l'applicazione di impostazioni di frammentazione peptidica più avanzate nell'Orbitrap. Nel complesso ciò si traduce in una maggiore copertura dell'ubiquitinoma.
Diversi aspetti del protocollo sono difficili da descrivere a parole. La visualizzazione di alcuni passaggi chiave è essenziale per poter ripetere queste analisi da parte di diversi operatori in un laboratorio diverso. La procedura sarà dimostrata da Karel Bezstarosti, che è un tecnico senior nel mio laboratorio.
Inizia preparando cellule coltivate o tessuto cerebrale del topo per l'esperimento. Se si lavora con le cellule, silyse il pellet cellulare da una piastra di coltura quadrata di 150 centimetri in due millilitri di ghiaccio freddo, 50 millimolare Tris HCL con 0,5% di deossicholato di sodio. Far bollire il lysate a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi sonicarlo a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Se si utilizza tessuto cerebrale di topo in vivo, lisciviarlo in un tampone ghiacciato contenente Tris HCL 100 millimolare, 12 deossicole di sodio millimolare e 12 millimolare di sodio N-lauroilsarcosinato. Sonicare il lysate per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi far bollire per cinque minuti a 95 gradi Celsius. Successivamente, quantificare la quantità totale di proteine utilizzando un kit di dosaggio proteico BCA di assorbimento calorimetrico, che dovrebbe essere di almeno diversi milligrammi per un'immunoprecipitazione peptidica diGly di successo. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le proteine etichettate leggere e pesanti in un rapporto uno a uno in base alla quantità totale di proteine.
Ridurre tutte le proteine con cinque DTT millimolare per 30 minuti a 50 gradi Celsius. E successivamente alchilati con 10 millimolare iodoacetamide per 15 minuti al buio. Quindi eseguire la digestione proteica con Lys-C per quattro ore.
E la digestione della triptina durante la notte a 30 gradi Celsius, o a temperatura ambiente. Il giorno successivo, dividere il campione in due tubi Eppendorf a due millilitri e aggiungere TFA al campione digerito a una concentrazione finale dello 0,5% Centrifugarlo a 10.000 volte G per 10 minuti per precipitare e rimuovere tutto il detersivo. Raccogliere il peptide contenente supernatante per il successivo frazionamento.
Utilizzare cromatografia ad alta fase inversa di pH C18 per frazionare i peptidi triptici. Preparare una cartuccia vuota a colonna di sei millilitri riempita con 0,5 grammi di materiale di fase stazionaria per circa 10 milligrammi di digestione proteica. Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavarli con circa 10 volumi di 0,1%TFA, seguiti da 10 volumi di acqua.
Elute i peptidi in tre frazioni utilizzando 10 volumi di colonna di formato ammonio millimolare con sette, 13,5 e 50% acetonitrile, rispettivamente. Quindi, litolizzare tutte le frazioni. Un lotto di anticorpi del motivo residuo di ubiquitina coniugati con la proteina A liquami di perline di agarosio è diviso in sei frazioni uguali.
Sciogliere le tre frazioni peptidiche in base alle direzioni del manoscritto e far girare i detriti. Aggiungere i supernaganti delle tre frazioni al liquame delle perline mantenendo le altre tre frazioni sul ghiaccio. E incubarli per due ore a quattro gradi Celsius su un'unità rotatoria.
Quindi, gira giù per le perline. Trasferire il supernatante in un nuovo lotto di perline. E ripetere l'incubazione con le restanti tre frazioni di liquami di perline.
Conservare i supernatanti per la successiva analisi globale del proteoma. E trasferire le perline su 200 punte di pipetta in microliter dotate di tappo filtrante GFF. Mettere le punte in tubi da 1,5 millilitri dotati di un adattatore per punta di centrifuga e lavare le perline tre volte con 200 microlitri di tampone IAP ghiacciato, seguiti da tre lavaggi con acqua purificata a freddo ghiacciato.
Ruotare le colonne a 200 volte G per due minuti tra un lavaggio e l'altro, assicurandosi di non lasciare asciugare la colonna. Dopo il lavaggio finale, elutare i peptidi con due cicli a 50 microlitri dello 0,15%TFA. Desalt i peptidi con una punta dello stadio C18 e asciugarli con centrifugazione sottovuoto.
Eseguire esperimenti LC-MS/MS su uno spettrometro di massa sensibile accoppiato a un sistema LC a nanoflusso. La colonna è impostata secondo le indicazioni manoscritte e conservata a 50 gradi Celsius. Utilizzare lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dipendente dai dati.
Raccogli gli spettri di massa MS1 ad alta risoluzione con un'impostazione di destinazione controllata dal guadagno automatizzato di 4E5 e un tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi. Eseguire l'analisi della spettrometria di massa nella prima modalità più intensa, utilizzando il metodo della velocità massima con un tempo di ciclo totale di tre secondi. Quindi eseguire un secondo ciclo di analisi DDA MS nella prima modalità meno intensa, che garantirà il rilevamento ottimale di peptidi a bassa abbondanza.
Filtrare gli ioni precursori in base ai loro stati di carica e all'assegnazione del picco monoisotopico. Ed escludere dinamicamente i precursori interrogati in precedenza per 60 secondi. Isolare i precursori peptidici con un filtro di massa quadrupolo impostato su una larghezza di 1,6 Thomson.
Quindi raccogli gli spettri MS2 nella trappola ionica con un controllo automatico del guadagno di 7E3 con un tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi e un'energia di collisione HCD del 30%Analizza i file grezzi della spettrometria di massa utilizzando un motore di ricerca appropriato, come la suite software MaxQuant liberamente disponibile basata sul motore di ricerca Andromeda. Aprire MaxQuant e selezionare i file di dati non elaborati appropriati. Impostare il numero di processori e fare clic sulla scheda parametri specifici del gruppo.
Selezionare la digestione e consentire tre scollatura persa. Quindi selezionare le modifiche e aggiungere digly alle modifiche delle variabili. Selezionare la scheda parametri globali e aggiungere il database di sequenza proteica corretto.
Lasciare le altre impostazioni come predefinite e premere Start per eseguire la ricerca nel database. Per l'analisi quantitativa dei file di esperimento SILAC, impostare la molteplicità su due e selezionare le etichette degli amminoacidi pesanti. Al termine della ricerca, importare i file di testo in Perseo.
Questo protocollo è stato utilizzato per identificare i siti di ubiquitinazione nelle proteine provenienti da cellule coltivate e materiale in vivo rilevando peptidi diGly con nanoflusso LC-MS/MS. Diversi miglioramenti sono stati apportati al protocollo esistente che ha portato a un maggior numero di peptidi digly rilevati. Un frazionamento grezzo in tre frazioni è stato eseguito prima dell'immunoprecipitazione.
Una delle frazioni contiene il peptide diGly trittico modificato K48 di ubiquitin, che è caratterizzato da un ampio picco nel cromatogramma LC. Inoltre, il regime di frammentazione peptidica è stato regolato per combinare le corse LC-MS con i primi e più bassi regimi di frammentazione più alti e più bassi nella procedura di analisi dei dati, che ha prodotto più di 4.000 peptidi diGly unici aggiuntivi. Più di 23.000 peptidi diGly possono essere regolarmente identificati da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un inibitore del proteasome.
Di tutti i peptidi diGly identificati su tre schermi biologici replicati, più di 9.000 erano presenti in tutti e tre, mentre più di 17.000 erano presenti in almeno due repliche su tre. Il numero di identificazioni peptidiche è altamente dipendente dalla quantità di materiale in ingresso. Un numero approssimativo di peptidi digli identificati può essere previsto a seconda del materiale di partenza, ma questi numeri sono solo stime e dipenderanno anche dal tipo di spettrometro di massa utilizzato.
Quando si effettua questo protocollo, l'esperienza precedente con i metodi di proteomica basati sulla spettrometria di massa e la manipolazione e l'analisi di quantità di campioni minuti sarebbe certamente vantaggiosa. Il software MaxQuant potrebbe essere sostituito da qualsiasi altro algoritmo di ricerca di database. Può essere utilizzato anche un diverso tipo di spettrometro di massa.
I risultati in termini di identificazioni peptidiche possono differire leggermente, ma questo è tipico per qualsiasi saggio di proteomica a base di spettrometria di massa. L'ubiquitina è importante nel progresso della degradazione mediata delle proteine, ma svolge anche un ruolo in molti altri processi nella cellula. Una conoscenza più profonda dell'ubiquitina come modifica post traslazione è fondamentale per comprenderne meglio la funzione.
