Il nostro protocollo osserva che l'uso di estratti renali da mucche e suini è una risorsa eccellente ed economica per lo studio della fisiologia renale, in particolare esaminando la correlazione tra il fattore di crescita endoteliale vascolare e altri analiti. È sempre stata una sfida correlare vegf, un fattore di crescita essenziale nell'angiogenesi degli organi, con altre proteine. Questa tecnica ci consente di esaminare l'associazione tra VEGF e aliti come gli ormoni.
Ciò farà sicuramente progredire la nostra base di conoscenze su questo importante fattore di crescita. Questo metodo può essere utile per correlare altri analiti negli estratti corticali renali oltre a quelli menzionati in questo video. La dimostrazione visiva aiuterà gli altri a ottenere risultati riproducibili senza errori di campionamento.
L'uso di tessuti freschi è essenziale per il successo di questa tecnica. È importante ottenere reni interi freschi immediatamente dopo la macellazione da un animale. Trasferire sempre il tessuto in laboratorio sul ghiaccio.
Usa forbici sterili, forcelle, un coltello e piatti petri per sezionare i reni e asportare la porzione di tessuto richiesta. Tagliare delicatamente il rene a metà lungo il piano sagittale e tagliare un pezzo di tessuto dalla regione della corteccia al centro del rene. Tritare il tessuto in piccoli pezzi con il coltello e trasferirlo in un tubo di microfugo con un millilitro di tampone di estrazione della llisi 1X RIPA ghiacciato.
Etichettare il tubo con dettagli specifici del campione e posizionarlo sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore portatile con una sonda sterile per omogeneizzare il tessuto per uno o due minuti fino a quando non sono visibili blocchi, quindi centrifugare immediatamente il tubo a 9.600 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, preparare aliquote separate del campione per ELISA e l'analisi totale delle proteine per evitare cicli multipli di congelamento /disgelo.
Prima di iniziare il saggio, portare tutti i reagenti e la piastra di dosaggio a temperatura ambiente rimuovendo i pozzi in eccesso e conservandoli a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Diluire il tampone di lavaggio 20X a 300 millilitri con acqua distillata doppia e impostare i pozzi vuoti senza alcuna soluzione. Aggiungere 50 microlitri di standard o campione e altri 50 microlitri di perossidasi di rafano coniugati ad ogni pozzo, quindi aggiungere immediatamente 50 microlitri di soluzione anticorpale ad ogni pozzo e sigillare la piastra.
Mescolare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare ogni bene con 200 microlitri di tampone di lavaggio. Aggiungere 50 microlitri di substrato A e substrato B ad ogni pozzo, mescolare delicatamente la piastra toccando sul lato, quindi sigillare e incubarla al buio per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo. Toccare delicatamente la piastra e leggere l'assorbanza a 450 nanometri con uno spettrofotometro. Preparare i reagenti e lavare il tampone come descritto in precedenza, quindi aggiungere 100 microlitri di standard o campione a ciascun pozzo, sigillare la piastra, mescolare bene e incubarla per due ore a 37 gradi Celsius.
Rimuovere il liquido in ogni pozzo e aggiungere 100 microlitri del reagente di rilevamento A.Sigillare la piastra e incubarla per un'altra ora. Successivamente, lavare ogni bene con 400 microlitri di tampone di lavaggio, quindi aggiungere 90 microlitri di soluzione di substrato a ciascun pozzo, toccare delicatamente la piastra e incubarla per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'ultima incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo, toccare delicatamente la piastra e leggere l'assorbanza a 450 nanometri con uno spettrofotometro.
Stimare la proteina totale degli estratti renali bovini e suini con un saggio BSA standard e utilizzare questa stima per normalizzare i risultati LH e VEGF-A-ELISA. I livelli medio e mediano di LH e VEGF sono stati calcolati sia per gli animali che per i sessi. Dopo aver verificato la normalità dei dati, sono stati utilizzati modelli di regressione lineare per esaminare la relazione tra LH e VEGF.
LH è risultato essere un predittore forte e significativo del VEGF sia nei reni bovini che in quello suino. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di campionare aree identiche in ogni tessuto. Una procedura simile può essere utilizzata per estrarre qualsiasi tipo di tessuto.
Ricorda di normalizzare gli aliti con l'estratto proteico totale di qualsiasi tessuto tu usi.
