NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

1. preparazione di soluzioni e di proteine ​​campioni per Spri <ol><li> Preparare 100 ml di soluzione di sale basso tampone fosfato salino (PBS) contenente fosfato 10 mM, 150 mM di cloruro di sodio e pH 7,4. </li><li> Preparare 50 ml di soluzione di PBS contenente fosfato salino elevato 10 mM, 750 mM di cloruro di sodio e pH 7,4. </li><li> Preparare 5 ml di 10 mM acetato di sodio. </li><li> Preparare uno stock di 5 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) diluita in basso contenuto di sale soluzione PBS. </li><li> Preparare una soluzione stock di ormone della crescita umano ricombinante (rhGH) ad una concentrazione di 1 mg / ml in soluzione di sale basso PBS. </li><li> Preparare soluzioni di anti-rhGH e anticorpo di controllo negativo ad una concentrazione di 100 ug / ml. </li></ol> 2. Preparare spri Chip Array anticorpi <ol><li> Pulire il chip per sonicazione in 120 ml di soluzione piranha stabilizzata (3: 1 di acido solforico concentrato al 30% di perossido di idrogeno) per 90 min a 50 ° C e seguire risciacquandoe sonicazione con acqua per 5 min. Poi, sciacquare chip con etanolo e asciugare con corrente di azoto. </li><li> Posizionare il chip dorato in una camera UV / ozono per 30 minuti per rimuovere eventuali contaminanti. </li><li> Aggiungere 150 mg di acido 11-mercaptoundecanoic a 20 ml di etanolo in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. </li><li> Posizionare chip provetta e microonde tubo / chip 50 W e 50 ° C per 5 min. </li><li> Sciacquare chip con etanolo e immergere in etanolo per 5 min. </li><li> Seguite da un risciacquo con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 150 mg di 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide a 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. </li><li> Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 150 mg di N-idrossisuccinimmide in 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. </li><li> Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. </li><li> Prepare 250 pM polietilene glicole (PEG, 800 Da) in 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. Nota: Microwaving PEG800 sulla superficie del sensore viene eseguita come una fase di blocco per impedire il legame non specifico di proteine ​​del siero e complessi quantum dot poi utilizzato nell&#39;esperimento. Ciò si ottiene PEG800 reagire con non occupati siti nudo oro sul chip. </li><li> Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. </li><li> Preparare 15 ug / ml di soluzione di anticorpo anti-rhGH e soluzione di controllo negativo di anti-immunoglobulina G (anti-IgG) e aggiungere 10 ml di ogni soluzione di anticorpi di un pozzo nel piatto ben 384. </li><li> Progettare il modello macchia nella microarrayer (4 x 7 quadranti per ogni campione) e il chip posto con anticorpi con un Teflon 500 micron capovolto pin. </li><li> Incubare Chip spotted per 2 ore a temperatura ambiente e in atmosfera umida di 75% o superiore. </li><li> Sciacquare e immergere in acqua per circuito integrato5 minuti. Poi, circuito integrato a secco con corrente di azoto. </li></ol> 3. SPRI dell&#39;esperimento e blocco <ol><li> Inizializzare lo strumento e selezionare directory. Selezionare vera fotocamera tempo e avviare la pompa a siringa a 1 ml / min per 10 ml di acqua degasata. Inserire circuito integrato nello strumento e tenere iniezione di acqua fino a quando tutte le bolle vengono rimosse. </li><li> Dopo aver sciacquato chip con 10 ml di acqua, avviare l&#39;acquisizione delle immagini, e seguire passando il buffer di basso contenuto di sale PBS e farlo girare a 1 ml / min per 5 ml e portata poi rallentare a 20 l / min per 20 min . </li><li> Selezionare l&#39;immagine altamente contrastata, che mostra gli anticorpi immobilizzati avvistati sul chip. </li><li> Selezionare e definire i 400 micron singoli spot circolari corrispondenti alle anticorpi immobilizzati. </li><li> Dopo lo strumento traccia le curve plasmon, scegliere un angolo di lavoro che ha la più alta pista nelle curve di riflettività. </li><li> Flusso un tampone di corsa a 20 ml / min di basse salt PBS attraverso il sistema finché il segnale da tutti i luoghi selezionati stabilizza. </li><li> Caricare il BSA (100 mcg / ml) in tampone di corsa nel loop del campione (150 microlitri) con la valvola di iniezione in posizione di carico. Poi commutare la valvola nella posizione di iniezione per iniettare la soluzione alla cella di flusso. Nota: BSA viene iniettato per legare covalentemente alla superficie reattiva ammina, il restante non legato BSA lavare la superficie attraverso buffer di risciacquo. </li><li> Iniettare 150 ml di una soluzione di 10 mM acetato di sodio sulla superficie e seguire da una iniezione di 150 microlitri di sale PBS. </li><li> Iniettare 150 ml di etanolammina (1 mM) per disattivare la superficie reattiva ammina. </li><li> Iniettare 150 ml di 10 mM acetato di sodio per lavare la superficie. </li><li> Quindi, passare il tampone di corsa di PBS con 50 ug / ml BSA ad un flusso di 250 ml / min per un totale di 5 ml. Nota: 50 mg / ml BSA viene aggiunto al tampone di corsa per il blocco addizionale del surfaccia per non covalente occupando i siti non-specifici e questo viene fatto per ridurre ulteriormente il legame non specifico di proteine ​​del siero alla superficie. </li><li> Cambia portata a 5 ml / min e lasciarlo stabilizzare per 20 min. </li></ol> 4. SPRI Rilevamento di ormone umano della crescita <ol><li> Preparare una soluzione di una concentrazione insieme di rhGH (30.000 pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / mL; 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml) nel siero 10% e diluito in PBS contenente 1 mg / ml BSA. </li><li> Preparare un 2: soluzione di 1 con l&#39;aggiunta di 1 ml di biotina marcati anticorpi di rilevamento anti-rhGH (6 micron) a 3 ml di streptavidina rivestite vicino punti quantici infrarossi (1 micron) in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga e incubare per 30 minuti per l&#39;accoppiamento efficace . </li><li> Iniettare 150 microlitri della soluzione di hGH spillo siero umano nel ciclo di iniezione. Ciò si traduce in un forte aumento del segnale seguito da un calo lento dal siero non specificatamente legato risciacquo della superficie. </li><li> Una volta che il segnoal stabilizza, lavare la superficie con una soluzione di 450 mM di cloruro di sodio aggiunto al tampone di corsa. </li><li> Diluire la soluzione di anticorpi anti-rilevamento rHGH e punti quantici ad una concentrazione di 10 nM (2: 1) con tampone di corsa (PBS con 50 mg / ml BSA) e iniettare nella cella di flusso. </li></ol> 5. spri Analisi dei dati Nota: Dopo l&#39;iniezione del rhGH spillo siero umano e quantum dot enhancer, un aumento della variazione riflettanza avviene a causa dello spostamento amplificato delle curve plasmoni. Il risultato un&#39;immagine differenza che mostra un&#39;immagine in scala di grigi correlare al segnale del sul chip. <ol><li> Importare i dati in un programma di analisi dei dati. Tracciare il segnale SPRI (% riflettività) in funzione del tempo (s) e determinare la differenza tra l&#39;anti-rhGH e macchie di anticorpi di controllo negativi dopo il lavaggio di sale. </li></ol> 6. ELISA Protocollo (1 ° giorno) <ol><li> Conservare tutti i componenti del dosaggio compresi in il kit ELISA rhGH a 2-8 ° C. Ciò include l&#39;anticorpo anti-rhGH piastre rivestite e, standard (0-5) nel siero di pecora, i controlli (1 e 2) nel siero umano, tampone di coniugato, (200x) tampone di lavaggio, cromogeno TMB (tetrametilbenzidina) e smettere di reagente. </li><li> Setup i reagenti e seguono i metodi descritti nel protocollo del kit ELISA commerciali. </li><li> In primo luogo, lasciare che l&#39;anticorpo anti-rhGH rivestito 96-pozzetti riscaldare a TA prima di aprire la confezione di alluminio. </li><li> Quindi rimuovere il numero desiderato di strisce a 8 pozzetti per il dosaggio e richiudere la busta chiusa contenente i restanti pozzi e conservare a 2-8 ° C. </li><li> Preparare standard mediante ricostituzione in 2 ml di acqua distillata per serie # 0, in 1 ml di acqua distillata per gli standard (1-5), in 1 ml di acqua distillata per i controlli (1 e 2). Di seguito una tabella dei corrispondenti concentrazioni degli standard e dei controlli (Tabella 1): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Standards </td><td> Concentrazione (ng / ml) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.94 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2.63 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 26.9 </td></tr><tr><td> Controllo N ° 1 </td><td> 1,22 ± 0,33 ng / ml </td></tr><tr><td> Control # 2 </td><td> 4,97 ± 1,25 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Concentrazioni delle norme e dei controlli inclusi nel kit ELISA commerciale. <ol start="6"><li> Preparare i campioni che consistono dell&#39;ormone rhGH nel siero umano 10% per le seguenti concentrazioni (Tabella 2): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> &lt;strong&gt; di esempio </td><td> Concentrazione (ng / ml) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Le concentrazioni dei campioni rhGH preparati nel 10% siero. <ol start="7"><li> Aggiungere 50 ml di ogni standard, controllo e campione in ciascun pozzetto (in triplicato). Sigillare i pozzetti e incubare con gli standard, controlli e campioni rhGH O / N a 4 ° C sotto un leggero scuotimento. </li></ol> 7. ELISA Protocol (2 ° giorno) <ol><li> Rimuovere la piastra da shaker e lasciarlo riscaldare per RT (15-20 minuti) prima di procedere con il test. </li><li> Rimuovere Anti-rhGH-HRP, tampone coniugato, tampone di lavaggio (200x), cromogeno TMB (tetrametilbenzidina), und reagente fermata dal frigorifero e lasciare il riscaldamento a RT. </li><li> Preparazione dei reagenti: (secondo le specifiche del produttore) <ol><li> Diluire Anti-rhGH-HRP 40x con il tampone coniugato. Preparare il tampone di lavaggio diluendo 200x con acqua distillata. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml di coniugato anti-rhGH-HRP in ogni pozzetto, sigillare i pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre scuotendo delicatamente. </li><li> Decantare la soluzione dai pozzetti e capovolgere la piastra e picchiettare asciutto su una carta assorbente. Quindi aggiungere 200 ml di tampone di lavaggio in ogni pozzetto. </li><li> Decantare la soluzione di lavaggio e rubinetto a secco su un tessuto assorbente. Ripetere questa operazione per 3 volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di Cromogeno in tutti i pozzetti entro 15 minuti dopo la fase di lavaggio. Incubare per 30 minuti a RT al buio, mentre scuotendo delicatamente. Le soluzioni si rivolgono da incolore a blu. </li><li> Aggiungere 100 ml di reagente bloccante in ogni pozzetto. Le soluzioni si rivolgono dal blu al giallo. Immediatamente, th leggeree assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm usando un lettore di micropiastre. </li><li> Tracciare la curva standard per le norme previste (0-5). Poi tracciare la densità ottica del 10% rhGH in campioni di siero ottenuti alla concentrazione di ogni campione. </li></ol>

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M.G. Sandros is a consultant for Horiba Scientific. She has received honoraria for participation in oral presentations from: Horiba Scientific and Syngenta. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those disclosed. No writing assistance was utilized in the production of this manuscript

Livelli irregolari di hGH, un ormone naturale, sono state collegate a numerosi disturbi medici che influenzano la crescita e lo sviluppo umano. Inoltre, la somministrazione esogena di rhGH è comunemente usato dagli atleti, anche se è proibito, come agente doping per migliorare le loro prestazioni. Sfide nella rilevazione rhGH risultato improprio dalla difficoltà nel distinguere esogeno hGH dalla forma endogena. Come tale, la tecnica attuale, approvato per rilevare hGH esogena si basa sulla misurazione del rapporto tra il 22 kDa isoforma hGH in relazione al 20 kDa isoforma. Poiché le richieste di prova per la misurazione isoforma di molteplici isoforme hGH contemporaneamente entro un breve periodo di tempo in un ampio intervallo di concentrazioni, di conseguenza, abbiamo considerato la piattaforma SPRI come una corrispondenza perfetta. Inoltre, il livello di hGH endogeno fluttuare un livello molto basso (0,03 ng / ml) nel sangue quindi il sistema di rivelazione deve essere in grado di misurare questa gamma comodamente con alta specificity. Come risultato, abbiamo anche indagato in questo studio il potenziale di Nano-SPRI come strumento diagnostico per hGH e confrontato direttamente con SPRI e la immunologico classica ELISA. Sulla base dei risultati ottenuti da questo studio, il vantaggio principale del metodo SPRI e Nano-SPRI è che le concentrazioni rHGH possono essere misurati in maniera più rapida rispetto al metodo più convenzionale ELISA. Una durata standard per la misurazione dei livelli di rhGH in un campione con il metodo di rilevazione diretto è stato di 1 ora, mentre il Nano-SPRI richiesto 2 ore a causa delle ulteriori passi nel processo. Nel complesso, con SPRI e Nano-SPRI esperimenti, prima dell&#39;iniezione di un campione, una fase di calibrazione è altamente raccomandato. Inoltre, l&#39;iniezione di un campione grezzo come risultati di siero umano in alcune interazioni non specifiche di conseguenza è indispensabile per iniettare un buffer di lavaggio elevata sale per rivelare solo interazioni specifiche. È anche interessante notare che una fase di lavaggio è assolutamente necessariodopo l&#39;introduzione di bloccare molecole sulla superficie del sensore, per rimuovere le molecole non legate. Per quanto riguarda i requisiti di tempo ELISA sono molto maggiore (~ 16-18 hr) per l&#39;analisi di un campione. È necessario un tempo di incubazione più come la sensibilità del test è migliorata appositamente per questo studio, come il focus era di confrontare il limite inferiore di rilevamento. La scelta della chimica superficiale varia da un&#39;applicazione all&#39;altra e questo potrebbe essere realizzato come una limitazione della tecnica SPRI. In questo studio, una vasta gamma e combinazione di linkers chimici e molecole di blocco sono stati valutati per ottenere la giusta combinazione per osservare ottimale efficienza vincolante rhGH sulla superficie del sensore. Ad esempio, in questo studio, la combinazione di BSA e PEG servito bene a minimizzare le interazioni non specifiche. Tuttavia, in un precedente studio 17, in cui il ligando di cattura era un aptameri, PEG solo servito come il migliore molecola di blocco. Le variabiliche l&#39;efficienza sul legame di analita ligando sono anche dipende dal pH, tampone e temperatura. Pertanto, con qualsiasi applicazione, queste variabili devono essere ottimizzate. Inoltre, è fondamentale per determinare la concentrazione ottimale individuazione del ligando alla superficie del chip. Un esperimento di titolazione con un intervallo di concentrazioni di ligandi immobilizzati viene eseguita prima di iniziare lo studio. Per quanto riguarda ELISA, un passo cruciale nella procedura era di decantare il tampone di lavaggio dai pozzetti battendo la micropiastra come questo garantito nessun liquido residuo è rimasto. Rimozione del tampone di lavaggio con pipetta non era sufficiente come qualsiasi liquido residuo interferiva con la lettura del campione mirato segnale. In riferimento alla sensibilità, ELISA (1 ng / ml) è paragonabile a SPRI (3.61 ng / ml), ma nano-SPRI (9,20 pg / ml) migliora la sensibilità di tre ordini di grandezza, consentendo misure ai livelli biologici inferiori di rhGH 0,03 ng / ml. Come abbiamo riportato in precedenza 16,17, il potenziamento del segnale impartita dal NanoEnhancers è attribuita a un effetto di carico di massa e il forte accoppiamento che esiste tra fluorophores NIR e propagano plasmoni di superficie per nanostrutture pellicola d&#39;oro. Anche se, Nano-SPRI aggiunge un passo in più per la procedura, questo livello di sensibilità può ampliare le applicazioni della tecnologia SPRI in vari punti vendita. Spri fornisce agli scienziati un profilo cinetico completo (K D, K e un K d) di anticorpo interazione / rhGH mentre ELISA può riportare solo i valori di affinità. Il coefficiente di variazione (CV) era inferiore al 10% per SPRI (4,1%) ed ELISA (6,5%), suggerendo buona riproducibilità. I valori di affinità ELISA e SPRI sono diversi perché gli anticorpi di cattura immobilizzati sul chip sensore sono diversi da anticorpi immobilizzati nella piastra a 96 pozzetti ELISA. Quanto Nano-SPRI è stato osservato un valore CV elevato (20%). Ci sono diversi parametri che possono contribuire come fonte di errors per la determinazione CV. Ad esempio, con l&#39;esperimento Nano-SPRI una concentrazione molto bassa di analita viene misurato, l&#39;aggiunta di NanoEnhancers aggiunge un altro passo della procedura e l&#39;esperimento è stato eseguito manualmente. Un molto buona correlazione tra Nano-SPRI ed ELISA è stato raggiunto per il rilevamento di rhGH in siero umano a spillo. Infine, ELISA può essere una tecnica affidabile tuttavia il metodo stesso richiede tempo che rende difficile l&#39;uso in situazioni che richiedono il monitoraggio in tempo reale e multiplexing, come è il caso con hGH. Inoltre, una caratteristica più interessante che non esaminato direttamente in questo studio che SPRI offre oltre ELISA, è la capacità di misurare centinaia di interazioni simultaneamente in tempo reale. Pertanto in futuro, metodo Nano-SPRI sarà valutato per rilevare molteplici biomarker simultaneamente in tempo reale (multiplazione) presenti nel siero a varie concentrazioni per esaminare il suo potenziale come strumento diagnostico clinica valida.

Ormone della crescita (hGH) è un peptide di 191 aminoacidi (22 kDa) prodotto dalla ghiandola pituitaria e direttamente rilasciato nel flusso sanguigno. Le interazioni tra la crescita peptide-ormone di rilascio ipotalamico (GHRH) e somatotropina inducono secrezioni pulsatili di hGH. Di conseguenza, i livelli di hGH variano da alti nelle 50-100 ng / ml ai minimi nell&#39;intervallo 0,03 ng / ml 1. Deficit o eccesso di hGH nel corpo possono provocare una vasta gamma di sintomi fisiologici anormali. Ad esempio, i livelli eccessivi di hGH può portare a gigantismo 2 e 3 del diabete. Livelli impoverito di hGH causano zucchero nel sangue nei neonati, e la densità ossea debole e la depressione negli adulti 4. L&#39;amministrazione della forma ricombinante di hGH (rhGH) migliora la massa muscolare magra, riducendo il grasso corporeo. In quanto tale, questa sostanza è diventato il farmaco di scelta per gli atleti professionisti e dilettanti in quanto migliora la forza fisica che conferisce un advantage a competizioni sportive. rhGH è vietato dall&#39;Agenzia mondiale antidoping (WADA) 5,6 e molto impegno da parte di ricercatori internazionali si è focalizzata sullo sviluppo di test in grado di rilevare la presenza o l&#39;effetto anabolizzante. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) è il metodo preferito per la determinazione di hGH in sangue intero 7. Sebbene, ELISA è una tecnica affidabile che offre buona sensibilità e selettività, è relativamente tempo e di manodopera. Inoltre, ELISA si basa sul rilevamento indiretto di hGH impiegando tag enzimatici. In contrasto, risonanza plasmonica superficiale (SPR) permette di riconoscere hGH direttamente senza l&#39;uso di etichette in tempo reale. Il principio di rilevamento dietro SPR coinvolge una superficie di rilevamento costituito da un prisma che è rivestito con uno strato sottile di metallo (oro o argento); quando una luce polarizzata monocromatica interagisce con la superficie metallica, si generano &quot;plasmoni di superficie&quot;. Il legame di un analitaad un recettore di superficie immobilizzato sulla superficie metallica perturba le condizioni di risonanza con conseguente tuffo risonanza spostata, che possono poi essere correlata alla concentrazione dell&#39;analita. Biosensori basati su SPR sono ora disponibili in commercio che offrono in tempo reale, etichetta tecnica libera per monitorare gli eventi biomolecolari vincolanti e reazioni biochimiche 8-10. Più recentemente, SPRI stato sviluppato in risposta alla necessità di multiplexing (cioè, il monitoraggio di più eventi di legame contemporaneamente), che non era possibile in biosensori SPR classici. Così, SPRI è emerso come uno strumento per monitorare più eventi contemporaneamente vincolanti. Sistemi spri attuali si basano su immagini microscopiche di una superficie che viene eccitato con luce ad un angolo e lunghezza d&#39;onda 10 specifico. L&#39;immagine viene poi catturato su un dispositivo (CCD) array di accoppiamento di carica. Ad oggi, ci sono stati alcuni test basati su SPR sviluppati per rilevare hGH 11-14. Una strategia particolare, Conosciuto come metodo isoforma 15, si basa sulla rilevazione del rapporto di 22 kDa hGH sul totale hGH, come livelli endogeni non-22-kDa goccia dopo somministrazione esogena rhGH. Recentemente, de Juan-Franco et al. 11 riferito sullo sviluppo di un immunosensor basato SPR per il rilevamento selettivo del 22 kDa e 20 kDa isoforme hGH in campioni di siero umano. Gli anticorpi monoclonali specifici per ciascuna isoforma stati immobilizzati direttamente sul sensore oro permettendo la misurazione di entrambe le isoforme simultaneamente in una singola iniezione con un limite di rilevazione a 0,9 ng ml -1. In alternativa, SPR è stato utilizzato per lo screening anticorpi con alta specificità per hGH 13. Se la concentrazione dell&#39;analita bersaglio scende sotto il limite della SPRI sistema di rilevazione (&lt;nM), si deve ricorrere ad amplificare il segnale SPRI tramite l&#39;utilizzo di nanoparticelle (Nano-SPRI). Tale amplificazione basato su SPR è stato ben documentato in letteratura 16-19 per vtipi arie di analiti e superfici. In questo lavoro, il potenziale analitico di biosensori basati SPRI e Nano-SPRI è stato esaminato, in particolare per il rilevamento di rhGH nel siero umano spillo, e il confronto della sua capacità di rilevamento direttamente ELISA. I seguenti parametri saranno rivisti e considerati: tempo di rilevamento, la sensibilità, profilo cinetico, riproducibilità e specificità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:131px;">DM1015</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:131px;">BP671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:131px;">AM09304BT-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide&#160;</td>
			<td style="width:188px;">TCI America</td>
			<td style="width:131px;">D1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:188px;">Acros Organics&#160;</td>
			<td style="width:131px;">141-43-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Chemicals&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Human HGH ELISA Kit&#160;</td>
			<td style="width:188px;">invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">KAQ1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H4522&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rabbit IgG Antibody&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">I5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11-mercaptoundecanoic acid&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">450561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Nanostrip&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Cyantek&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">130672</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:188px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">00-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Polyethylene glycol (800 Da)&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">729108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Recombinant Human Growth Hormone&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">869008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:188px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Chemicals&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated near infrared quantum dots&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Q10171MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">UV/Ozone Procleaner</td>
			<td style="width:188px;">Bioforce Nanosciences&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Microwave reactor&#160;&#160;</td>
			<td style="width:188px;">CEM Corporation</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Discover system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">SPRi-Arrayer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:188px;">LabNext Xactll Microarray System&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">SPR biochip</td>
			<td style="width:188px;">HORIBA&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">SPRi-Lab+</td>
			<td style="width:188px;">HORIBA</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Synergy Mx Multimode Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:188px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">ScrubberGen</td>
			<td style="width:188px;">HORIBA</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Data Analysis software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative analysis of human growth hormone in serum using spri, nano-spri and elisa assays

Metodi sensibili e selettivi per l&#39;individuazione di ormone della crescita umano (hGH) su una vasta gamma di concentrazioni (alti livelli di 50-100 ng ml - 1 e livelli minimi di 0,03 ng ml - 1) nel sangue circolante sono essenziali come livelli variabili possono indicare la fisiologia alterata. Ad esempio, disturbi della crescita che si verificano durante l&#39;infanzia può essere diagnosticata misurando i livelli di hGH nel sangue. Inoltre, l&#39;uso improprio di ricombinante hGH nello sport non solo pone una questione etica presenta anche gravi minacce per la salute di chi abusa. Una strategia popolare per misurare hGH uso improprio, si basa sulla rilevazione del rapporto di 22 kDa hGH a totale hGH, come livelli endogeni non 22 kDa goccia dopo esogeno ricombinante hGH (rhGH) amministrazione. Risonanza plasmonica di superficie di imaging (SPRI) è uno strumento analitico che consente il monitoraggio diretto (senza etichetta) e la visualizzazione delle interazioni biomolecolari registrando cambiamenti del ind rifrazioneex adiacente alla superficie del sensore in tempo reale. Al contrario, il metodo colorimetrico più utilizzato, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) utilizza anticorpi di rilevamento marcato con un enzima per misurare indirettamente concentrazione dell&#39;analita dopo l&#39;aggiunta di un substrato che induce un cambiamento di colore. Per aumentare la sensibilità di rilevamento, amplificato SPRI utilizza un formato dosaggio panino e vicino infrarosso (punti quantici QDs) per aumentare la potenza del segnale. Dopo il riconoscimento diretta SPRI di ricombinante rhGH nel siero umano a spillo, il segnale SPRI è amplificata dalla iniezione sequenziale di anticorpi rilevazione rivestito con QD nel vicino infrarosso (Nano-SPRI). In questo studio, il potenziale diagnostico di SPRI diretta e amplificato è stata valutata per la misurazione rhGH spillo nel siero umano e confrontato direttamente con le funzionalità di un kit ELISA disponibile in commercio.

Le prestazioni di SPRI e Nano-SPRI (SPRI impiegando le NanoEnhancers) è stato confrontato con ELISA per la rivelazione di rhGH in un ambiente complesso. Le differenze nella configurazione di questi metodi sono descritte brevemente. Per SPRI (rilevazione diretta, figura 1), l&#39;anticorpo di cattura è immobilizzato sulla superficie e quindi il campione viene iniettato e vincolante di analita alla superficie del sensore è misurata direttamente in tempo reale e modo senza etichetta. Tuttavia, con Nano-SPRI (Figura 1), dopo l&#39;analita lega alla superficie del sensore, una iniezione consecutiva è seguita con punti quantici rivestite con anticorpi di rilevamento per amplificare il segnale SPRI. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig1.jpg" /> Figura 1. Una rappresentazione schematica a confronto in modalità diretta (SPRI) e modalità amplificata (Nano-SPRI) di rilevazione di rhGH in c<html> leganti (rhGH o IgG anticorpi specifici) maleducati campioni. sono stati immobilizzati in un formato array sul biochip SPRI. Proteina bersaglio (rhGH) spillo nel siero umano introdotto alla superficie del sensore sono direttamente rilevati (SPRI) e in sequenza evidenziata con NanoEnhancers (Nano-SPRI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Come per ELISA, le piastre a pozzetti multipli arrivano già pre-funzionalizzati con anticorpo di cattura e poi campione viene introdotto, l&#39;analita di interesse si legano. Un anticorpo di rilevazione è introdotta seguita da aggiunta del substrato. La densità ottica viene quindi misurata a 450 nm. In questo studio, un kit ELISA commerciale (Figura 2) è stato utilizzato per misurare rhGH spillo nel siero umano 10%. 8 / 53508fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Una rappresentazione schematica della procedura di saggio ELISA. proteine ​​rhGH (ovali blu) è introdotto per i pozzi che sono stati pre-funzionalizzati con anticorpi monoclonali (giallo) specifici per rhGH. Interazioni non specifiche vengono eliminati sciacquando i pozzetti con tampone di lavaggio, seguito dall&#39;introduzione di un anticorpo di rilevazione prefunctionalized con perossidasi di rafano (HRP, viola). La soluzione cambia colore dopo l&#39;aggiunta del substrato tetrametilbenzidina (TMB, oro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3 rappresenta la curva di titolazione di rhGH spillo nel siero umano al 10% ed è tracciata contro la DO ottenute a 450 nm. Una buona risposta lineare è stata osservata e il limite di rilevazione è stato determinato in 1 ng / ml. Il coefficiente di variation (CV) è stato del 6,5% che suggerisce una buona riproducibilità. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig3.jpg" /> Figura 3. ELISA analisi dei dati. La concentrazione di rhGH spillo nel siero è tramato contro il DO ottenute a 450 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Avanti, l&#39;individuazione di rhGH spillo nel siero umano è stata valutata con SPRI. Rilevamento diretto di rhGH portato con la curva concentrazione gradiente corrispondente (figura 4), ​​ciascun punto rappresenta il valore medio della differenza riflettività calcolata da tre curve cinetiche SPRI per ciascuna concentrazione. Il limite di rilevazione (LOD) è stato determinato in 3,61 ng / ml. Il test di rilevazione diretta SPRI era altamente riproducibile come il CV del testera solo 4,1%. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig4.jpg" /> Figura 4. diretto SPRI rilevamento di hGH spillo nel siero umano al 10%. La normalizzato trama cinetica risultante SPRI dopo l&#39;iniezione di varie quantità di hGH spillo nel siero umano, seguito dall&#39;iniezione di un buffer di sale (linea verticale tratteggiata) per rimuovere non Interazioni specifico d&#39;. Una curva gradiente di concentrazione che rappresenta il legame di varie quantità di hGH spillo nel siero umano per la superficie del sensore che è stata prefunctionalized con biotinilato specifico-hGH-anticorpo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per aumentare la sensibilità del biosensore SPRI, NanoEnhancers (QD pre-funzionalizzati con anticorpi di rilevamento) sono in sequenza introdotti alla superficie del sensore al fine di evidenziare la presenza di rhGH spillo nel siero umano. Dopo sottrazione del fondo, i NanoEnhancers sono stati in grado di amplificare la risposta biosensore fino al 7,9%, comunque, con il minimo cambio di segnale (Immunoglobulina G (IgG) anticorpi specific, variazione 0,38% a riflettività; Figura 5 a regioni controllate di interesse Imaging. la superficie del sensore ha rivelato che solo le regioni di interesse che hanno gli anticorpi rhGH-specifici immobilizzati esperienza il più grande cambiamento di contrasto corroborare direttamente con la risposta sensorgram cinetica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig5.jpg" /> Figura 5. Rilevamento di rhGH usando un test panino spillo nel siero umano 10%. SPRI trama cinetica dopo l&#39;iniezione di rhGH (30 ng / ml) in tampone (PBS 10 mM, 150 mM di cloruro di sodio, pH = 7,4) su un pre Chip -functionalized con acido 11-mercaptoundecanoic / rhGH-anticorpo specifico e controllo IgG-anticorpi poi bloccato con BSA, seguito dall&#39;aggiunta di rilevamento di anticorpi rivestite punti quantici (NanoEnhancers). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per dimostrare la praticabilità del biosensore Nano-SPRI, è stato valutato il campo di misura di rhGH in campioni grezzi. Un intervallo di lavoro esteso da 30.000 pg / ml a 0,25 pg / ml determinato come risposta all&#39;aggiunta di NanoEnhancers (figura 6). Vale la pena notare che ogni punto sulla curva di titolazione è mediata da tre esperimenti indipendenti. Di conseguenza, il limite inferiore di rilevamento è stata calcolata in 9,20 pg / ml e il coefficiente di variazione è stata del 20%. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig6.jpg" /> Figura 6.Nano-SPRI rilevamento di hGH spillo nel siero umano. Normalizzato SPRI rappresentazione trama cinetica del segnale hGH_specific_Anti-QD-amplificata per campioni di siero umano a spillo con diverse concentrazioni di hGH. Una linea verticale tratteggiata (grigio) rappresenta il punto di iniezione del tampone di corsa. (b) Una curva gradiente di concentrazione rappresenta il legame di NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QD) dopo l&#39;iniezione di varie quantità di hGH spillo nel siero umano sulla superficie del sensore che è stato prefunctionalized con anticorpi acido 11-mercaptoundecanoic / hGH-specifico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig6large.jpg" target="_blank">Cliccando qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Successivamente, il cambiamento che avviene nella curva riflettività SPR in funzione della concentrazione è stata confrontata tra diretto e metodo del saggio biologico NanoEnhancer (Figura 7). Per la de direttaTecnica protezione tra il 25 e 0,25 pg / ml, il segnale ha iniziato a plateau e questo non è sorprendente in quanto queste concentrazioni sono inferiori al LOD di 3 ng / ml (Figura 7). Allo stesso modo, per la tecnica amplificato, concentrazioni al di sotto del LOD di segnale di 9,2 pg / ml hanno iniziato a plateau e ha mostrato praticamente nessuna variazione. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig7.jpg" /> Figura 7. Un&#39;analisi comparativa di SPRI con Nano-SPRI. Questo grafico a barre rappresenta la variazione percentuale riflettività (% R) dopo l&#39;introduzione di rhGH spillo nel siero umano (rilevazione diretta) seguito dal iniezione di NanoEnhancers (rilevamento amplificato) per 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pagina = &quot;1&quot;&gt; Inoltre, è stata valutata la specificità del biosensore Nano-SPRI. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) spillo nel siero umano è stato iniettato come controllo poiché hGH stimola la secrezione di IGF-1 attraverso il recettore dell&#39;ormone della crescita sulla membrana degli epatociti. Dopo l&#39;iniezione del IGF-1 nel siero, i NanoEnhancers stati iniettati in sequenza e la risposta del segnale SPR non hanno mostrato alcun legame specifico (Figura 8). Tuttavia, quando rhGH spillo nel campione di siero è stato iniettato allo stesso punto funzionalizzati con anticorpi rhGH, è stato osservato il miglioramento del segnale. In conclusione, la piattaforma Nano-SPRI ha dimostrato eccellenti specificità e selettività per rhGH. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig8.jpg" /> Figura 8. Valutazione della Nano-SPRI selettività verso rhGH. La risposta biosensore Nano-SPRI dopo l&#39;iniezione di rhGH (nero) e di IGF-1 (rossa) in ssiero carpiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Un&#39;analisi di correlazione è stata eseguita utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson per determinare la correlazione tra l&#39;intensità del segnale SPRI e valori di densità ottica ELISA (Figura 9). A p-value &lt;0.01 è stato considerato significativo. Come illustrato in questo grafico, vi è una buona correlazione tra i livelli nel siero umano rHGH spillo misurati mediante SPRI ed ELISA. Il valore di R è stato 0,9263 per 9 diversi campioni. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig9.jpg" /> Figura 9. Pearson analisi di correlazione tra il ELISA e Nano-SPRI. La trama è correlato intensità del segnale Nano-SPRI (asse y) con densità ottica ELISA (asse x) valori. (Pearsil coefficiente di correlazione n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig9large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La costante di equilibrio di dissociazione (K D) è stato determinato utilizzando il software GraphPad per ELISA. Il valore calcolato K D è stato di circa 79 nM (Tabella 3). Gli su (K a) e off (K d) i tassi non è stato possibile determinare con metodo ELISA. Tuttavia, utilizzando il software di analisi dei dati, il metodo di rilevazione diretta ha portato con K valore D di 23 pM utilizzando la massa molecolare di 22 kDa che corrisponde a una molecola rhGH. L&#39;on e off tassi sono stati calcolati per essere 6.1 x10 7 M -1 s -1 e 1,33 x 10 -3 sec -1, rispettivamente. Questo si traduce per sé che il 0,13% del rhGH e complessi anticorpo decadimento al secondo. Come per l&#39;unaesperimento spri mplified, una interazione globale più forte è stata osservata tra NanoEnhancers e rhGH come l&#39;affinità di legame calcolato è stato determinato per essere 4:03. Inoltre, un tasso di associazione più forte è stata osservata per NanoEnhancers e rhGH di anticorpo di cattura / rhGH, tuttavia il tasso di dissociazione suggerisce che il 0,26% del NanoEnhancer / rhGH / Cattura anticorpo decadimento al secondo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Metodo </td><td> K D (affinità) </td><td> K un (tasso on-) </td><td> K d (off-rate) </td><td> LOD </td></tr><tr><td> ELISA </td><td> 79.45 x 10 -9 M </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 ng / ml </td></tr><tr><td> Spri </td><td> 23.2 x 10 -12 M </td><td> 6.1 x 10 7 M -1 s -1 </td><td&gt; 1.33 x10 -3 sec -1 </td><td> 3.61 ng / ml </td></tr><tr><td> Nano-SPRI </td><td> 4.33 x 10 -12 M </td><td> 7.54 x10 8 M -1 sec -1 </td><td> 2.62 x10 -3 sec -1 </td><td> 0,0092 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Completa l&#39;analisi dei dati cinetica. Valutazione della affinità, on-rate e off-rate delle risposte anticorpali utilizzando GraphPad (ELISA) e l&#39;analisi dei dati del software (SPRI e Nano-SPRI). La determinazione della avidità utilizzando la massa molecolare di 22 kDa che corrisponde ad una molecola rhGH stata scelta. I limiti di rilevamento sono stati determinati per tutti e tre gli studi che utilizzano Excel.

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Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Il lavoro proposto valuta il potenziale diagnostico di superficie per immagini risonanza plasmonica diretto e amplificato (SPRI) saggi, in particolare per l&#39;individuazione di ormone della crescita umano ricombinante nel siero umano a spillo, confrontando SPRI risultati direttamente con disponibile in commercio saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) kit.

Analisi comparativa di ormone umano della crescita nel siero Utilizzando SPRI, Nano-SPRI e saggi ELISA

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.4K Views.  University of North Carolina at Greensboro.  Il lavoro proposto valuta il potenziale diagnostico di superficie per immagini risonanza plasmonica diretto e amplificato (SPRI) saggi, in particolare per l'individuazione di ormone della crescita umano ricombinante nel siero umano a spillo, confrontando SPRI risultati direttamente con disponibile in commercio saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) kit. 

Video: Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Ricerca

Biologia

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...