Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Preparazione di strumenti e soluzioni di lavoro <ol><li> Preparare la soluzione di acqua pesce. Ottenere una soluzione stock sciogliendo 2 g di &#39;Ocean istantanea&#39; sali marini in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 1,5 ml di brodo di pesce di acqua a 1 L di acqua distillata per preparare pronto a utilizzare l&#39;acqua del pesce (/ sali marini ml 60 mcg concentrazione finale). Autoclave pronto all&#39;uso pesci d&#39;acqua prima dell&#39;uso. Questa soluzione viene utilizzata come mezzo zebrafish. </li><li> Preparare metilcellulosa per il montaggio degli embrioni. Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 50 ml di acqua sterile pesce. Facilitare la dissoluzione utilizzando un magnete su una piastra di agitazione. La completa dissoluzione della polvere può richiedere diverse ore. Controllare la soluzione per chiarezza e aliquote in piccoli tubi. Conservare a -20 ° C per mesi e scongelare le aliquote a uso. Centrifugare la metilcellulosa a 950 xg per 5 minuti prima di utilizzare. Evitare cicli di congelamento-scongelamento di aliquote. </li><li> Preparare 50 ml di tricaine / etil 3-amminobenzoato msale ethanesulphonate (soluzione) sciogliendo 200 mg di tricaine in 100 ml di acqua e aggiustare il pH a 7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservare questo stock a 4 ° C per non più di 30 giorni. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare secondo le appropriate linee guida di trattamento. </li><li> Indurre stress ossidativo in embrioni di zebrafish <ol><li> Preparare una soluzione ossidante per l&#39;induzione dello stress ossidativo generico: Marca 50 ml di soluzione ossidante con l&#39;aggiunta di H 2 O Soluzione 2 stock (perossido di idrogeno; 100 mm) per l&#39;acqua il pesce. Usare H 2 O 2 di una concentrazione finale tra 2 mM e 100 mM. Preparare questa soluzione poco prima dell&#39;uso. La soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. Non conservare questa soluzione. ATTENZIONE: H 2 O 2 è pericoloso e nocivo per inalazione e ingestione. Il contatto con materiale combustibile può provocare un incendio. Maneggiare sotto cappa aspirante e usura pers appropriatedispositivi di protezione onal. </li><li> Preparare una soluzione ossidante per l&#39;induzione dello stress ossidativo dei mitocondri-derivati: ottenere una soluzione stock ossidante (5 mm), sciogliendo 3,9 mg di rotenone in 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione a temperatura ambiente al buio. <ol><li> Sciogliere soluzione stock rotenone a 10 ml di acqua i pesci per fare una soluzione pronta all&#39;uso. Utilizzare rotenone ad una concentrazione compresa tra 5-50 micron. Non utilizzare rotenone a concentrazioni superiori a 100 micron. A concentrazioni appropriate, questa soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. ATTENZIONE: Rotenone è tossico e pericoloso. Manipolare secondo adeguate prudenza. </li></ol></li><li> Indurre stress ossidativo gene knock-down: knock-down dell&#39;espressione genica nrf2a in embrioni di zebrafish da morpholino microiniezione come precedentemente riportato da Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Indurre oxidative stress dopo il danno tissutale: generare un margine ferita alla pinna caudale di embrioni di zebrafish a 72 HPF come precedentemente descritto da 2009 39 Niethammer et al.. </li></ol></li><li> Preparare 5 ml di soluzione ROS-rilevazione per singola cella metodo di ROS-rilevamento: <ol><li> Soluzione per il rilevamento ROS generale: sciogliere la sonda molecolare ROS-sensitive generico in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), al fine di preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). Questa soluzione deve essere preparata poco prima dell&#39;uso. </li><li> Soluzione per il rilevamento specifico ROS indotta dai mitocondri: Poco prima dell&#39;uso, sciogliere un mitocondriale sonda ROS-sensibile con DMSO fare un soluzione stock 5 mm. Sciogliere soluzione di riserva in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). NOTA: Evitare la luce e l&#39;ossigeno l&#39;esposizione di soluzioni di lavoro ROS di rilevamento e le rispettive soluzioni stock. Proteggere il tubo dalla luce utilizzandoun foglio di alluminio. Non conservare o di riutilizzo sonde disciolti in HBSS. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C per un mese. ATTENZIONE: Maneggiare le sonde molecolari e DMSO sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate. </li></ol></li><li> Preparare 5 ml di soluzione ROS di rilevamento per l&#39;intero metodo di montaggio ROS-rilevamento: Sciogliere la soluzione generica sonda magazzino ROS-sensitive (stabilizzato in DMSO) in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2.5-5 micron). Evitare la luce e l&#39;esposizione all&#39;ossigeno. Proteggere il tubo dalla luce. Preparare questa soluzione prima dell&#39;uso. Non conservare o ri-utilizzare questa soluzione. ATTENZIONE: Maneggiare sonde molecolari sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate. </li><li> Fai 25 ml di Soluzione di arresto con l&#39;aggiunta di 10 ml di siero fetale bovino a 15 ml di PBS 1x. Mantenere soluzione sterile. Conservare questa soluzione a 4 ° C. Questa soluzione è necessaria solo per la singola cella - metodo di rilevazione ROS. </li><li> Impostare l&#39;incubatore d&#39;aria zebrafish a 28 &amp;# 176; C. </li><li> Impostare la centrifuga a 4 ° C per il metodo di rilevamento ROS singola cella. </li></ol> 2. L&#39;accoppiamento di pesci adulti e selezione di embrioni di zebrafish <ol><li> Set-up adulto coppia zebrafish attraversa secondo protocolli standard 40. Selezionare la linea transgenica appropriato in conformità con le specifiche esigenze sperimentali. </li><li> Raccogliere le uova e metterli in un piatto di 90 mm con terreno di pesci d&#39;acqua / embrione. Conservare le uova a 28 ° C fino embrioni svilupparsi e crescere allo stadio desiderato di sviluppo (ad esempio, 48 HPF, 72 hpf; hpf: ore dopo la fecondazione). </li><li> Schermo per lo sviluppo di embrioni. Escludere tutte le uova non fecondate o embrioni sottosviluppati. </li><li> Anestetizzare gli embrioni con l&#39;aggiunta di 1 ml di tricaine (soluzione) in 50 ml di acqua i pesci. </li><li> Selezionare embrioni fluorescenti Tg sotto uno stereomicroscopio. </li></ol> 3. Trattamento di embrioni con ossidante agente <ol><li> Utilizzare almeno 30 embrioni tra 48 hpf e 72 HPF per ogni condizione diversa. Lavare embrioni due volte con acqua pesce fresco per rimuovere tricaine. </li><li> Suddiviso embrioni fluorescenti in tre piatti. Mettere non più di 30 embrioni / piatto. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 10 ml della soluzione ossidante o 10 ml di acqua pesce come soluzione di controllo. </li><li> Incubare gli embrioni per 10 minuti a 1 ora a 28 ° C. Il periodo di incubazione dipende dal livello di stress ossidativo essere indotta in tessuti specifici. Brevi periodi sono i migliori come le cellule colpite da stress ossidativo progressivamente subiscono la morte delle cellule. </li><li> Trasferimento degli embrioni in un nuovo piatto contenente HBSS ed embrioni di lavaggio agitando. Pre-HBSS caldo a 28 ° C. </li></ol> 4. Intero monte ROS Metodo di rilevazione <ol><li> Raccogliere embrioni dopo il trattamento ossidante e mettere non più di 10 embrioni in un piccolo tubo. Risciacquare con HBSS il più possibile. Proteggere il tubo da luce utilizzando un foglio di alluminio. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di ROS rilevamento perogni provetta. </li><li> Incubare embrioni al buio per 15 minuti a 28 ° C per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Durante il tempo di incubazione preparare un vetrino per tutta l&#39;analisi embrione. Mettete 300 ml di metilcellulosa su una &quot;depressione&quot; vetrino e stenderlo sulla superficie del vetro con un puntale. Evitare le bolle mentre si rilascia il metilcellulosa. </li><li> Al termine del periodo di incubazione, rimuovere immediatamente la soluzione ROS rilevamento e lavare due volte con 2 ml di HBSS. Lavare gli embrioni capovolgendo la provetta diverse volte. Non pipetta o vortice. </li><li> Aspirare embrioni superiore in una pipetta Pasteur di vetro. Posizione embrioni vicino all&#39;apertura della pipetta e delicatamente espellere nel metilcellulosa. Orientare gli embrioni adeguatamente con un filo di nylon fine. </li><li> Confrontare la fluorescenza di embrioni di controllo con embrioni trattati. In alternativa, fissare parametri del stereomicroscopio a fluorescenza o un microscopio confocale in modo che tutti gli embrioni vengono esposte utilizzando lo stessoImpostazioni di imaging. </li></ol> 5. Single Cell Method ROS rilevamento <ol><li> Inizia dal punto: 3.5. Assicurarsi di avere almeno 35 embrioni per ogni condizione. </li><li> Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto. Rimuovere l&#39;acqua i pesci, per quanto possibile. Aggiungere 10 ml di ghiacciata PBS 1x e 400 ml di inibitori della proteasi Cocktail. Dechorionate manuale embrioni con una pinza e rimuovere il sacco vitellino con un ago sottile. Nota: la rimozione sacco vitellino assicura campioni puliti per la successiva analisi FACS. Questo passaggio può essere evitato secondo strumento FACS. </li><li> Trasferimento de-yolked embrioni in una piastra a 24 pozzetti multiwell (15 embrioni / pozzetto) e rimuovere tutti i pesci d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 300 ml di HBSS, 30 microlitri collagenasi P, 50 microlitri tripsina-EDTA in ciascun pozzetto. </li><li> Omogeneizzare embrioni pipettando gentilmente su e giù con un puntale stretto (1.000 ml). </li><li> Incubare a 28 ° C per 20 min e omogeneizzare campioni pipettando ogni 5 min. </li><li> Controllare DISR tessutouption osservando un&#39;aliquota di omogenato al microscopio composto. Facilitare sospensione singola cella pipettando. Non incubare gli embrioni per più di 30 min. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 200 ml di soluzione di arresto. Mescolare pipettando delicatamente. </li><li> Trasferire sospensione di cellule in una provetta pre-raffreddata con fondo stretto. Tenere la provetta in ghiaccio ed evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 250 xga 4 ° C. </li><li> Rimuovere la fase superiore e risospendere le cellule con ghiaccio freddo HBSS pipettando delicatamente. </li><li> Contare le celle e assicurarsi di avere lo stesso numero di cellule in tutti i campioni. Non utilizzare meno di 2 x 10 6 cellule. </li><li> Celle di centrifugazione per 5 minuti a 250 xg a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con 1 ml di ghiaccio raffreddato HBSS contenente la sonda ROS-sensitive. </li><li> Incubare la provetta a temperatura ambiente per 3 minuti al buio. Tempo di incubazione variare a seconda del livello di stress ossidativo e di tegli sensibilità della sonda. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta FACS. Tenere le provette su ghiaccio ed evitare l&#39;esposizione alla luce prima analisi FACS. </li><li> Ordinare le celle con un cell sorter fluorescenza-attivato (FACS). Lunghezze d&#39;onda impostato conformemente fluorescenza Tg tessuto (ad esempio, GFP) e gli spettri di eccitazione / emissione della sonda molecolare utilizzato per il rilevamento ROS (ad esempio, sonde specifiche mitocondriali ROS-sensibili, generici sonde sensibili ROS). </li><li> Per ogni condizione, misurare tutti i campioni all&#39;interno della stessa sessione sperimentale, applicando le stesse impostazioni FACS. Calcolare la percentuale di cellule fluorescenti come media di diverse repliche biologiche. Analizzare almeno due repliche per ogni condizione. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Fasi critiche La procedura per la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni di zebrafish qui descritti comprende due metodi differenti. L&#39;intero metodo di montaggio ROS rilevamento è principalmente un test qualitativo per ROS-rilevamento, mentre il metodo ROS rilevamento singola cella consente misurazioni quantitative più specifici (Figura 1). Entrambi i metodi offrono un modo rapido e semplice per valutare in vivo ROS-rilevazione sugli embrioni di zebrafi...

Lo stress ossidativo è specificamente definita come una condizione che deriva da uno stato redox cellulare sbilanciato. Le reazioni redox complesse che si verificano normalmente all&#39;interno delle cellule determinano il redox-stato cellulare. Reazioni redox comprendono tutte le reazioni chimiche che consistono nel trasferimento di elettroni tra atomi di molecole biologiche che producono riduzione e ossidazione di molecole (ad esempio reazioni redox). Queste reazioni sono catalizzate da specie attivata elettronicamente (cioè le specie pro-ossidanti), caratterizzati da una instabilità strutturale estremo e l&#39;attivazione spontanea di elettroni sbilanciati che scambiano con biomolecole limitrofi. Queste reazioni irregolari risultano in danni al DNA, proteine ​​carbossilazione, e l&#39;ossidazione dei lipidi, e alla fine portano alla morte delle cellule 1. Aumento dei livelli di stress ossidativo sono stati associati con l&#39;invecchiamento e la progressione di diversi stati patologici 2. Lo stress ossidativo èstato segnalato per essere responsabile di alterazioni vascolari nel diabete e le malattie cardiovascolari 3,4. Esso svolge anche un ruolo fondamentale nella degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson 5. Inoltre, lo stress ossidativo è stato dimostrato come un fattore critico nel governo progressione del cancro ed eventi metastatici 6,7. Inoltre, le risposte infiammatorie e immunitarie possono suscitare e sostenere ulteriormente lo stress ossidativo 8. In cellule viventi, specie pro-ossidative sono derivati ​​da ossigeno (ROS, specie reattive dell&#39;ossigeno) o di azoto (RNS; specie reattive). ROS includono il radicale idrossile, l&#39;anione superossido (OH.) (O 2 -), e il perossido di idrogeno (H 2 O 2). Il primario RNS è l&#39;ossido di azoto (NO).. Una serie di specie reattive secondarie può essere generato da interazioni spontanee between ROS e RNS o metalli liberi ioni 9. Ad esempio, l&#39;anione superossido reagisce con l&#39;ossido di azoto per formare peroxynitrate (ONOO -), mentre H 2 O 2 reagisce con Fe 2 + genera radicali idrossilici. ROS e RNS, grazie alla loro capacità di reagire con diverse biomolecole, sono considerati una minaccia pericolosa per il mantenimento dello stato fisiologico redox 10. Per mantenere le cellule stato redox sono dotati di una serie di disintossicante molecole antiossidanti ed enzimi. La superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi e Peroxiredoxins costituiscono essenzialmente l&#39;antiossidante enzimatico-arsenale che fornisce protezione cellulare da specie pro-ossidanti compreso H 2 O 2, OH e Oono -. 11. Anche molecole anti-ossidanti come la vitamina C ed E, polifenoli e CoenzymeQ10 (CoQ10) sono di importanza critica per placare ROS e la loro de pericolosarivati ​​12,13. Tuttavia, una eccessiva produzione di ROS e RNS, o una disfunzione del sistema antiossidante, sposta la redox-stato cellulare verso lo stress ossidativo 14. Oltre alla loro connotazione negativa, ROS può svolgere vari ruoli fisiologici in cellule di diversa origine. Cellule normalmente producono ROS come molecole di segnalazione per mediare eventi biologici normali, come la difesa ospite e ferita riparazione 15-17. Specie reattive sono normalmente prodotti in cellule da enzimi intracellulari come NOx (NADPH) e XO (xantina ossidasi) in risposta a fattori di segnalazione, fattori di crescita e le fluttuazioni dei livelli di calcio intracellulare 18,19. E &#39;stato riportato che i ROS differenzialmente può modulare l&#39;attività di importanti fattori nucleari come p53 o componenti cellulari come l&#39;ATM-chinasi, il principale regolatore della risposta al danno del DNA 20. Analogamente ROS influenzano fortemente segnalazione cellulare mediando the ossidazione e inattivazione di proteina tirosina fosfatasi (PTP), che sono stabiliti come regolatori critici di trasduzione del segnale 21. Inoltre, le metodologie di proteomica basata dimostrano che RNS sono anche responsabili di specifiche modificazioni delle proteine ​​e alterazioni della segnalazione molecolare. RNS reagiscono con i gruppi tiolo cisteina li modificano in S-nitrothiols (SNO) e innescando meccanismi molecolari concomitanti con stati patologici come le malattie infiammatorie e autoimmuni 22,23. Da esperimenti di coltura cellulare solo parzialmente riproducono la moltitudine di fattori che agiscono in vivo, è di grande interesse per eseguire studi redox in modelli animali 24,25. Per ottenere ciò, il zebrafish è stato considerato un modello animale vertebrato adatto per studiare la dinamica di stress ossidativo 26. Lo zebrafish è un nuovo modello di sistema che concede numerosi vantaggi di studiare eventi cellulari e genetici durante vertebrato development e la malattia. Grandi cluster di embrioni possono essere generate e disponibili settimanale per esigenze sperimentali. Inoltre, la straordinaria chiarezza ottica di embrioni di zebrafish, nonché le loro piccole dimensioni, permette l&#39;imaging singola cellula e l&#39;inseguimento dinamico in un insieme di organismi 27. Nell&#39;ultimo decennio, un numero considerevole di zebrafish mutanti sono stati generati per modellare condizioni patologiche umane come il cancro e malattie genetiche 28-31. Ancora più importante, una moltitudine di linee transgeniche è stata prodotta per consentire ampie possibilità di manipolazioni genetiche e biologiche 32. Ad esempio, le linee transgeniche zebrafish tessuto-specifici sono regolarmente utilizzati per studi in vivo. Queste linee esprimono una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore selezionato, offrendo la possibilità di identificare le singole cellule in vivo, così come la struttura anatomica di comprendere. Diversi studi tossicologici hanno già utilizzato tegli Zebrafish per valutare l&#39;effetto in vivo delle sostanze chimiche sulla omeostasi redox, suggerendo l&#39;idoneità di questo vertebrato come modello animale per il campo della scoperta di nuovi farmaci e stress ossidativo 33-35. Anche se alcuni sonde fluorescenti sono stati testati per monitorare lo stress ossidativo in larve di zebrafish 36,37, non ci sono test stabiliti per rilevare e misurare i livelli di stress ossidativo nei tessuti zebrafish e cellule viventi. Qui si descrive un procedimento per la quantificazione in vivo di stress ossidativo in cellule di embrioni di zebrafish vivente. Strumenti di imaging, FACS ordinamento, sonde fluorescenti e le condizioni pro-ossidative sono tutti combinati per generare un semplice test per l&#39;individuazione e la quantificazione delle specie ossidanti in embrioni e tessuti di zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Alti livelli di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) possono causare un cambiamento di stato redox cellulare verso condizione di stress ossidativo. Questa situazione provoca ossidazione di molecole (lipidi, DNA, proteine) e porta alla morte delle cellule. Lo stress ossidativo influenza anche la progressione di diverse condizioni patologiche come il diabete, retinopatie, neurodegenerazione, e cancro. Quindi, è importante definire strumenti per studiare le condizioni di stress ossidativo non solo a livello di singole cellule, ma anche nel contesto di organismi interi. Qui, si considera l&#39;embrione zebrafish come un utile sistema in vivo tali studi e presentare un protocollo per misurare in vivo stress ossidativo. Approfittando di sonde fluorescenti ROS e linee fluorescenti transgeniche zebrafish, sviluppiamo due metodi differenti per misurare lo stress ossidativo in vivo: i) un &quot;metodo ROS-detection intero embrione&quot; per la misura qualitativa dello stress ossidativo e ii) uno &quot;unicellulare metodo di rilevazione ROS &quot;per misure quantitative di stress ossidativo. Qui, dimostriamo l&#39;efficacia di queste procedure, aumentando lo stress ossidativo nei tessuti da agenti ossidanti e metodi fisiologici o genetici. Questo protocollo è suscettibile per schermi genetiche in avanti e vi aiuterà relazioni indirizzo di causa-effetto di ROS in modelli animali di patologie legate allo stress ossidativo come disturbi neurologici e cancro.

Applicando il metodo descritto qui, possiamo facilmente misurare e rilevare lo stress ossidativo (e livelli di ROS) nei tessuti embrionali di zebrafish. Dopo aver attraversato zebrafish adulto, uova vengono raccolte e permesso di sviluppare a 28 ° C per 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Al fine di indurre stress ossidativo, proponiamo due diversi approcci: 1) Il trattamento degli embrioni con forti reagenti pro-ossidanti o 2) promuovere la formazione di ROS dopo la lesione del tessuto. Nel...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Views.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Video: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Misura Stress ossidativo Resistenza<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96 pozzetti micropiastre

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...