Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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Gli autori vorrebbero riconoscere che questa ricerca ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea per il progetto PATROLS, nell'ambito della sovvenzione n. 760813

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le applicazioni per i modelli epatici 3D variano considerevolmente a seconda del particolare endpoint biochimico o della via di esito avverso presa di mira. Ogni modello ha i suoi benefici e limiti, dalla variazione interdonore nei modelli di epatociti umani primari (PHH) alla ridotta attività del citocromo p450 nei modelli basati sulla linea cellulare, ma tutti sono preziosi a se stessi6,12,18,19. Quando si valuta la genotossicità ci sono limitazioni nei modelli compatibilità con endpoint approvati dalla regolamentazione come il saggio di micronucleo in vitro, poiché è necessaria la proliferazione attiva. Ciò è necessario, poiché la valutazione della genotossicità richiede che la quantificazione dei danni fissi al DNA sia valutata dopo la divisione cellulare quando vi è la possibilità di riparare il DNA per correggere le lesioni transitorie. Sfortunatamente, gli epatociti altamente differenziati (cioè gli sferoidi a base di HepaRG) o le microtissudi PHH, che si ritiene presentino le caratteristiche epatiche più fisiologicamente rilevanti, formano modelli statici (non proliferativi)12,19,20. Di conseguenza, il modello sferoide 3D HepG2 qui presentato fornisce un modello alternativo adatto in grado di supportare i test di genotossicità. Gli sferoidi a base di linea cellulare HepG2 hanno sufficienti cellule che dividono attivamente sulla superficie esterna degli sferoidi pur mantenendo caratteristiche epatiche di base, come la produzione di albumina e urea e alcune attività CYP4505,12,19. Principalmente questo modello epatico in vitro è stato sviluppato per integrare il saggio del micronucleo, poiché questo è uno dei due saggi in vitro raccomandati nella batteria per i test di genotossicità8,10,11,21. Tuttavia, il modello può essere prontamente applicato alle tecnologie di analisi del sequenziamento del DNA e di espressione genica (RNA), mentre ha il potenziale per essere ulteriormente adattato e utilizzato per altri endpoint di danno al DNA, come il saggio della cometa. Tuttavia, è importante considerare il ruolo svolto dalle interferenze ENM in alcune analisi degli endpoint. Ad esempio, le analisi basate sulla citometria del flusso potrebbero non essere adatte per la valutazione della genotossicità ENM specificamente a causa dell'interferenza delleparticelle 22.
Un fattore limitante dei modelli di sferoide che subiscono attivamente la divisione cellulare è la loro dimensione. L'ottimizzazione della densità di semina è fondamentale in quanto devono esserci abbastanza cellule che consentano al modello di continuare a proliferare; ma non un numero di cellule troppo alto, il che fa diventare lo sferoide e troppo compatto, portando ad un aumento del nucleo necrotico. Si ritiene che la causa di questa necrosi sia limitata all'ossigeno e alla diffusione dei nutrienti, poiché si pensa che il limite di questa diffusione sia di circa 100 - 150 μm ditessuto 23,24. Tuttavia, questo dipende dal tipo di cella, dal numero di cella, dalle interazioni dell'impalcatura e dalle condizioni dicoltura 25. Poiché, è stato dimostrato che circa 700 μm di diametro è il limite per evitare l'insorgenza prematura della necrosi al centro degli sferoidi C3A, la semina di 4000 cellule HepG2 per sferoide assicura che il diametro del modello al momento dell'esposizione sia di ≤500 μm26. Inoltre, Shah et al. Per superare questo problema, il modello ideato nel presente protocollo subisce un passaggio critico in cui la goccia appesa viene trasferita in pozzi rivestiti di agarosio dopo la formazione iniziale dello sferoide. Ciò garantisce un maggiore volume di mezzo di coltura presente per sostenere il numero sempre crescente di cellule all'interno degli sferoidi. Di conseguenza, il modello sferoide HepG2 rimane percorribile oltre il 70% dopo 10 giorni in coltura e può essere utilizzato per la valutazione del rischio a lungo termine in vitro.
Mentre il modello di sferoide HepG2 può supportare sia regimi di esposizione acuta che a lungo termine, il mezzo di coltura cellulare rinfrescante durante lunghi periodi di coltura è limitato per questo modello in quanto la sostituzione completa del mezzo non è consigliata a causa della potenziale perdita degli sferoidi. Si presume che con le esposizioni enm, la tendenza di dispersioni omogenee dell'ENM ad agglomerare e sedimentare sia elevata. Tuttavia, è degno di nota il fatto che la velocità con cui un sedimento ENM può variare a seconda dei parametri delle particelle (ad esempio, dimensioni, forma e densità) e può essere determinata teoricamente utilizzando il modello di sedimentazione, diffusione e dosimetria in vitro (ISDD), o i suoi derivati recenti, spesso menzionati quando l'esposizione all'ENM (sospensione)si avvicina a 27,28. Con questa mente, si presume che se solo il 50% del mezzo di coltura cellulare viene accuratamente rimosso dalla superficie della coltura cellulare, l'interruzione e la successiva rimozione della dose ENM dovrebbero in teoria essere minime. Tuttavia, con il moto browniano in gioco, questo potrebbe non essere strettamente il caso e ulteriori lavori sulla deposizione e la sedimentazione di ogni particolare ENM da testare dovrebbero essere intrapresi per garantire che la dosimetria corretta sia mantenuta per tutti i regimi di esposizione a lungo termine27. Principalmente questa è una potenziale limitazione da considerare quando si eseguono ripetuti regimi di dosing in quanto ciò potrebbe essere fondamentale per la concentrazione finale accumulata. Le esposizioni a base chimica, d'altra parte, pur non senza i propri limiti da considerare, offrono un approccio più semplicistico in quanto le sostanze chimiche tendono a rimanere in soluzione e quindi una sostituzione diretta della concentrazione chimica originale oltre alla concentrazione appena aggiunta garantisce che qualsiasi sostanza chimica persa durante il ristoro del supporto sia sostituitadi conseguenza 29. Le applicazioni future includerebbero la valutazione dell'idoneità del modello per i regimi di esposizione ripetuta durante i periodi di coltura a lungo termine, poiché le strategie di dosamento ripetute sono di fondamentale importanza per valutare la capacità di un particolare sistema di organi di migliorare o superare gli eventuali effetti avversi indotti dal bioaccumulo di una sostanza xenobiotica.
In conclusione, questo modello epatico in vitro 3D ha la capacità di essere utilizzato per valutare una serie di scenari di esposizione realistici, fornendo così un futuro approccio in vitro per supportare meglio sia l'ENM che la valutazione del rischio chimico in modo di routine e facilmente accessibile.

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Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

A causa del rapido sviluppo e implementazione di una vasta gamma di nanomateriali ingegnerizzati (ENM) in una pletora di applicazioni basate sull'uomo (ad esempio, cibo, cosmetici, abbigliamento, attrezzature sportive, elettronica, trasporto e medicina), è inevitabile che gli esseri umani saranno esposti regolarmente all'ENM. Con questo, ci sono accresciuto problematiche che le nuove caratteristiche fisico-chimiche specifiche delle dimensioni che ritengono questi materiali vantaggiose in numerose applicazioni potrebbero causare effetti negativi sulla salute umana e sull'ambiente in concomitanza. Attualmente sono in atto molte attività internazionali per riflettere attivamente esposizioni più fisiologicamente rilevanti a queste ENM e valutare la potenziale tossicità di questi materiali in scenari di esposizione acuta, a lungo termine e ripetuta a basse dosi.
La tossicologia epatica è fondamentale quando si considera l'esposizione all'ENM, poiché è ampiamente noto che il fegato è un sito importante di accumulo di ENM dopol'esposizione 1,2. Inoltre, il fegato è il sistema di organi primario per il metabolismo e la disintossicazione delle sostanze che entrano nella circolazionesistemica 3. Sulla base della comprensione accettata che i modelli di epatociti 2D non imitano accuratamente le complessità di intricate interazioni multicellulari o rappresentano adeguatamente l'attività metabolica osservata in vivo, è stata stabilita una maggiore attenzione allo sviluppo di modelli epatici 3D robusti e fisiologicamente rilevanti per le tecnologie sostitutive in vivo4,5. L'utilizzo di tecnologie avanzate di coltura 3D migliora la longevità dei modelli epatici in vitro consentendo di esaminare regimi di esposizione ripetuta a lungo termine. Inoltre, questo formato di coltura avanzato promuove la formazione di caratteristiche fisiologiche e organotipiche migliorate come canaliculi biliari, processi di trasporto attivi e migliori capacità di metabolizzazione del farmaco CYP450, migliorando così la prevedibilità deimodelli 6. Gli attuali modelli epatici in vitro 3D costituiti da mono colture (solo epatociti) o co-colture (epatociti con cellule non interpachimali) esistono in diversi formati, che vanno da microtissuali o sferoidi in piastre di adesione ultrabassi, sferoidi a goccia appesi, cellule incorporate in matrici e/o impalcature e piattaforme di coltura cellulare microfluidica, che sono tutti considerati efficaci modelli avanzati in vitro per la valutazione della tossicitàepatica 6,7. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi di modelli sono ad alta manutenzione, richiedono attrezzature specializzate e sono costosi. Inoltre, questi modelli sono spesso statici (cioè modelli cellulari non divisi) che ne impediscono l'uso nella valutazione degli endpoint di pericolo, come i test di genotossicità utilizzando metodi che quantificano i danni fissi al DNA. La genotossicità è un prerequisito fondamentale nella tossicologia normativa ed è una componente vitale della valutazione del rischio di qualsiasi tossico8. Non esiste un singolo saggio che possa essere applicato per quantificare tutte le forme di danno al DNA che possono insorgere a seguito dell'esposizione a un agente esogeno. Tuttavia, un componente centrale della batteria di prova della genotossicità in vitro è il test del micronucleo, che è una tecnica affidabile e sfaccettata che misura il danno cromosomico lordo9. Si tratta di una tecnica gold standard descritta dalla Linea guida 487 del test dell'OCSE, per la valutazione del danno al DNA in vitro e della genotossicità e fa parte del requisito della batteria di provaper la valutazione del rischio normativo 10,11.
La linea cellulare del carcinoma epatocellulare umano, HepG2, è ampiamente utilizzata per lo screening iniziale della valutazione del pericolo in quanto le cellule sono prontamente disponibili, relativamente economiche per la fonte, semplici da coltura e suscettibili di screening ad altaproduttività 12,13. Quando coltivati in strutture sferiche 3D, è stato dimostrato che ricapitolano bene il microambiente epatico e offrono un modello epatico con capacità proliferative sufficienti a supportare il saggio micronucleo3. È stato stabilito un ulteriore sviluppo dei modelli di sferoidi HepG2 per migliorare la longevità e la funzionalità epatica del modello al fine di supportare la valutazione del rischio di genotossicità su regimi di esposizione ripetuta a lungo termine (≤14 giorni). Pertanto, in linea con i principi delle 3R per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale, è stato stabilito il presente protocollo per fornire un modello epatico 3D avanzato in vitro in grado di valutare in modo affidabile più endpoint tossicologici (ad esempio, funzionalità epatica, marcatori (pro)infiammatori, citotossicità e genotossicità) a seguito di esposizioni chimiche ed ENM acute, a lungo termine e ripetute in modo routine e facilmente accessibile.
Qui presentiamo un metodo per stabilire una linea cellulare di epatociti 3D fisiologicamente rilevante basata sul sistema di modelli in vitro per la valutazione del rischio di genotossicità a seguito di esposizioni ENM acute o ripetute a lungo termine. Il protocollo può essere suddiviso in 6 fasi chiave: coltivare cellule HepG2 crioconservate; Preparazione sferoide HepG2; Trasferimento sferoide HepG2 dalla caduta sospesa alla sospensione dell'agarosio; Raccolta sferoide HepG2; test e punteggio del micronucleo; analisi dei dati.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

A causa del rapido sviluppo e implementazione di una vasta gamma di nanomateriali ingegnerizzati (ENM), l'esposizione all'ENM è inevitabile e lo sviluppo di sistemi di test in vitro robusti e predittivi è essenziale. La tossicologia epatica è fondamentale quando si considera l'esposizione all'ENM, poiché il fegato svolge un ruolo vitale nell'omeostasi metabolica e nella disintossicazione, oltre ad essere un sito importante di accumulo di ENM dopo l'esposizione. Sulla base di questo e della comprensione accettata che i modelli di epatociti 2D non imitano accuratamente le complessità delle intricate interazioni multicellulari e dell'attività metabolica osservate in vivo, c'è una maggiore attenzione allo sviluppo di modelli epatici 3D fisiologicamente rilevanti su misura per scopi di valutazione del rischio ENM in vitro. In linea con i principi dei 3R per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale, è stato sviluppato un modello epatico basato sulla linea cellulare 3D HepG2, che è un sistema intuitivo ed economico in grado di supportare regimi di esposizione ENM estesi e ripetuti (≤14 giorni). Questi modelli sferoidi (diametro di ≥500 μm) mantengono la loro capacità proliferativa (cioè modelli di cellule divisorie) consentendo loro di essere accoppiati con il saggio micronucleo "gold standard" per valutare efficacemente la genotossicità in vitro. La loro capacità di riferire su una serie di endpoint tossicologici (ad esempio, funzione epatica, risposta (pro)infiammatoria, citotossicità e genotossicità) è stata caratterizzata utilizzando diverse ENM sia nei regimi di esposizione acuta (24 ore) che a lungo termine (120 h). Questo modello epatico in vitro 3D ha la capacità di essere utilizzato per valutare esposizioni ENM più realistiche, fornendo così un futuro approccio in vitro per supportare meglio la valutazione del rischio ENM in modo di routine e facilmente accessibile.

L'idoneità di questo modello di sferoide epatico 3D a base di linea cellulare per la coltura a lungo termine e la valutazione del rischio genotossico è stata valutata conducendo la caratterizzazione di base per determinare la vitalità e la funzionalità epatica del modello per la durata di 14 giorni in coltura e la sua applicabilità per il test del micronucleo.
Caratterizzazione di base del modello sferoide epatico 3D HepG2 Prima di qualsiasi valutazione tossicologica in vitro, è importante verificare che gli sferoidi 3D HepG2 si siano formati correttamente prima di eseguire il trasferimento di agarosio o il trattamento chimico /ENM. Gli sferoidi HepG2 prodotti con il metodo della goccia appesa di solito durano da 2 a 3 giorni dopo la semina (4000 cellule/sferoide) per formare sferoidi compatti e sferici con un diametro medio di 495,52 μm W x 482,69 μm H, come mostrato nella figura 5A-5C. Gli sferoidi HepG2 che si sono formati correttamente e sono accettabili per essere utilizzati per la valutazione tossicologica in vitro devono avere una struttura compatta e sferica con una superficie liscia e senza proiezioni visive. La figura 5 fornisce esempi di sferoidi di buona qualità (figura5D-F)e di scarsa qualità (figura5G-I). Quest'ultimo dovrebbe essere scartato. Tipicamente, il 90-95% degli sferoidi formati per piastra si formerà correttamente ed sarà vitale per ulteriori sperimentazioni.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figura 5: Immagini di microscopia leggera che mostrano la morfologia naturale degli sferoidi HepG2 formati tramite il metodo della goccia appesa . (A-C) mostrano il giorno 2 e (D-I) Giorno 4 Sferoidi epatici HepG2 dopo la semina. (D-F) sono esempi di sferoidi HepG2 di buona qualità, mentre(G-I)mostra sferoidi mal formati. Tutte le immagini sono state scattate su un obiettivo X20 utilizzando un microscopio. La barra di scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per confermare ulteriormente la fattibilità dello sferoide HepG2, è possibile eseguire un saggio colorimetrico di base Bromocresol Green Albumin (BCG) o un saggio di Urea per valutare la loro funzionalità epatica. La funzionalità epatica è stata valutata in linea con la fattibilità utilizzando il test di esclusione blu di Trypan per un periodo di coltura di 14 giorni per determinare la longevità del modello di sferoide epatico e stabilire se poteva supportare la valutazione del rischio a lungo termine o ripetuta basata su ENM / chimica(figura 6). La concentrazione di albumina rimase costante per tutta la durata del periodo della coltura. La produzione di urea mostra un aumento della concentrazione di urea prodotta per sferoide per una settimana di coltura prima di raggiungere un altopiano entro il giorno 7. È importante notare che i livelli di albumina e urea prodotti negli sferoidi 3D HepG2 sono sostanzialmente superiori a quelli osservati nella stessa linea cellulare coltivata in formato 2D. In effetti, le colture 2D delle cellule HepG2, i livelli di picco di albumina e urea erano rispettivamente 0,001 mg/mL e 0,010 ng/μL. Inoltre, in precedenti lavori pubblicati da Shah et al. utilizzando un sistema sferoide HepG2 quasi identico, gli autori evidenziano un notevole miglioramento dell'attività metabolica (CYP1A1 e CYP1A2) nei sistemi modello 3D HepG2 in vitro rispetto alle cellule HepG2 coltivate in 2D5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figura 6: Dati di caratterizzazione di base a 14 giorni per gli sferoidi epatici HepG2. A seguito del trasferimento dalla caduta sospesa, (A) evidenzia la fattibilità del modello sferoide HepG2 per un periodo di 14 giorni, mentre (B) e (C) evidenziano rispettivamente la funzionalità dell'albumina e dell'urea simile al fegato. Dati meschino ± SEM presentati, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Con l'inevitabile sviluppo di un nucleo necrotico, una limitazione nota delle colture di sferoidi epatiche 3D, è stato necessario stabilire la fattibilità di questo modello basato su HepG2 per dimostrare che era in grado di sostenere regimi di esposizione a lungo termine (5-10 giorni) mantenendo la capacità proliferativa necessaria per supportare il test del micronucleo5. In effetti, questo modello di sferoide epatico 3D ha dimostrato di mantenere la vitalità del >70% in 10 giorni in coltura. Sulla base di questo e in combinazione con la funzionalità epatica sostenuta osservata durante il periodo di coltura di ≥14 giorni, questo modello di sferoide epatico 3D può quindi supportare regimi di esposizione ENM ripetuti a lungo termine fino a 10 giorni (cioè, prima che la vitalità degli sferoidi scende al di sotto del 70%). Per riferimento, si consiglia che i livelli di albumina per gli sferoidi HepG2 sementi a 4000 cellule/sferoide siano di ≥20,0 ng/μL, mentre la produzione di urea dovrebbe essere di ≥0,25 ng/μL prima di condurre una valutazione tossicologica in vitro con questo modello.
Valutazione della genotossicità dei nanomateriali ingegnerizzati Per la valutazione della genotossicità, il saggio del micronucleo è stato utilizzato per determinare la presenza di micronuclei a seguito di esposizioni acute (24 ore) e a lungo termine (120 h) enm. L'aflatossina B1 è un agente cancerogenoepatico noto 16,17 ed è un controllo positivo raccomandato per il test del micronucleo. Esperimenti di ottimizzazione hanno dimostrato che 0,1 μM di Alfatossina B1 induce una risposta genotossica positiva significativa (≥ aumento di 2,0 volte) negli sferoidi epatici 3D HepG2 e quindi viene utilizzata in ogni saggio di micronucleo condotto con questo modello. Per garantire la validità dei risultati del test del micronucleo utilizzando il modello sferoide HepG2, la frequenza micronuclea di fondo per le cellule HepG2 utilizzate in questo modello 3D in vitro dovrebbe trovarsi entro un intervallo dello 0,6% - 1,2%. Di conseguenza, l'alfatossine B1 dovrebbe indurre una risposta genotossica di almeno due volte superiore a quella osservata con il controllo negativo; pertanto, 0,1 μM di alfatossina B1 dovrebbero indurre una frequenza micronuclei compresa tra l'1,5% e il 3,0%. Utilizzando questi parametri di controllo, la genotossicità associata all'ENM in vitro può quindi essere valutata in modo affidabile. Sulla base della linea guida 487 dell'OCSE per i test, è importante notare che durante la prova di un ENM o di una sostanza chimica, le concentrazioni selezionate non devono indurre più del 55% ± 5% di citotossicità (indicata da una riduzione dei valori CPBI o RVCC in relazione al controllo negativo)11. La figura 7 illustra i dati generati quando l'aflatossina B1 e due ENM (biossido di titanio (TiO2) e sliver (Ag)) sono state valutate a seguito di esposizioni sia acute che a lungo termine negli sferoidi HepG2, e il successivo potenziale genotossico è stato analizzato utilizzando il saggio del micronucleo. Entrambe le ENM valutate sono state testate a una dose non citotossica e bassa di 5,00 μg/mL su un'esposizione acuta (24 ore) e un regime di esposizione a lungo termine (120 h). Una tendenza simile per la genotossicità sia nelle ENM TiO2 che ag può essere osservata, per cui l'elevata risposta di genotossicità risultante dall'esposizione di 24 ore non era evidente dopo un'esposizione a lungo termine di 5 giorni. Ciò nonostante la genotossicità sostenuta indotta dal controllo positivo dell'aflatossina B1 in entrambi i punti di tempo.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figura 7: Valutazione della genotossicità a seguito dell'esposizione di TiO2 e Ag ENM sugli sferoidi epatici HepG2. Valutazione della genotossicità (frequenza micronuclea) mediantel'esposizione a lungo termine (120ore)a 5,00 μg/mL di TiO2 e Ag ENM. Il controllo negativo è solo un supporto, mentre il controllo positivo è di 0,1 μM di aflatossina B1. Dati meschino (n=2) ± SD. Significatività indicata in relazione al controllo negativo: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Questa procedura è stata stabilita per essere utilizzata per lo sviluppo di colture epatiche 3D avanzate in vitro, che possono fornire una valutazione più fisiologicamente rilevante dei rischi genotossici associati alle esposizioni di nanomateriali sia su regimi acuti che a lungo termine, a dosi ripetute.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l&#39;Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

Un modello biomimetico per il cancro al fegato per studiare le interazioni tumore-stroma in un ambiente 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tessuto 3D combinata Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioingegneria

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medicina

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Double Resin Casting seguito da Tomografia Micro-Computerizzata per Analisi 3D del Fegato

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

Imaging 3D della matrice extracellulare del fegato in un modello murino di steatoepatite non alcolica

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

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