Caratterizzare le proprietà di trasporto delle terapie e dei loro portatori è fondamentale per garantire risposte biologiche efficaci. Questi metodi aiutano a progettare portatori di farmaci caricati in modo ottimale per colpire i tessuti caricati negativamente. Il principale vantaggio di queste tecniche è la loro capacità di prevedere meglio gli efficaci terapeutici in vivo attraverso una serie di esperimenti in vitro che caratterizzano il trasporto del soluto attraverso i tessuti.
Le malattie della cartilagine, come l'osteoartrite, rimangono non trattate a causa dell'incapacità dei farmaci di penetrare nella densa matrice cartilaginea avascolare, richiedendo ai portatori di farmaci di prologo l'efficacia terapeutica. Inizia usando una delicata salvietta per rimuovere delicatamente il PBS in eccesso dalle superfici di tre millimetri di diametro, espianto di cartilagine spesso un millimetro. Utilizzare un equilibrio per registrare rapidamente il peso umido di ogni espianto e posizionare immediatamente le espianto in un bagno PBS per prevenire la disidratazione.
Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione portante peptidica cationica appena preparata e 30 micromolare etichettata fluorescentmente per pozzo ai pozzi interni di una piastra da 96 po 'e utilizzare una spatola per aggiungere un espianto a ciascun pozzo di soluzione. Riempire ciascuno dei pozzi circostanti con 300 microlitri di PBS e coprire la piastra con un coperchio. Sigillare i bordi della piastra con pellicola flessibile per ridurre al minimo l'evaporazione e posizionare la piastra su uno shaker in un incubatore Di 37 gradi Celsius per 24 ore a 50 giri al minuto, con un'orbita di 15 millimetri.
Al termine dell'incubazione, trasferire il bagno di equilibrio da ogni pozzo in singoli tubi in polipropilene e effettuare diluizioni seriali dalla soluzione portante peptidica cationica micromolare stock 30 per generare una curva standard. Quindi, trasferire 200 microlitri di ogni soluzione e standard in singoli pozzi di una piastra nera da 96 porri e ottenere letture di fluorescenza di ogni campione e standard in base alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dell'etichetta fluorescente. Per determinare la profondità della penetrazione del portatore di peptidi cationico all'interno di un'espianto di cartilagine, utilizzare un bisturi per tagliare il diametro di sei millimetri, una cartilagine spessa un millimetro espianta a metà e idratare i pezzi a mezzo disco risultanti con l'inibitore del proteo integrato PBS.
Applicare epossidico al centro di un pozzo di una camera di trasporto unidimensionale progettata su misura e fissare un semi-disco di espianto all'interno del pozzo con il lato superficiale dell'espianto rivolto verso l'alto lato della camera. Rimuovere la colla in eccesso dal pozzo per evitare il contatto con la superficie di diffusione della cartilagine e aggiungere 80 microlitri di inibitore della proteasi integrati PBS su entrambi i lati dell'espianto. Pipettare il liquido su e giù su un lato dell'espianto per verificare la presenza di perdite dall'altro lato.
Se non è presente alcuna perdita, sostituire l'inibitore della proteasi integrato PBS dal lato a monte con 80 microlitri di fluorescenza micromolare etichettata soluzione portante peptidica cationica e posizionare con cura la camera di trasporto in un piatto di coltura cellulare. Coprire la base del piatto con PBS per evitare l'evaporazione della soluzione portante peptidica cationica. Fare attenzione che non vi sia alcun contatto diretto tra le soluzioni delle camere a monte e a valle.
Posizionare il piatto coperto su uno shaker per limitare la sedimentazione delle particelle per quattro o 24 ore a temperatura ambiente e 50 giri al minuto, con un'orbita di 15 millimetri. Alla fine dell'incubazione, rimuovere le espianto dalla camera e tagliare circa 100 micron di fette spesse dal centro di ogni espianto. Posizionare ogni fetta di espianto tra uno scivolo di vetro e uno scivolo di copertura e idratare le fette con un inibitore fresco della proteasi integrato PBS.
Fissare la diapositiva sullo stadio di un microscopio confocale e ottenere una pila Z di immagini fluorescenti attraverso l'intero spessore della fetta con ingrandimento 10X. Aprite il file di immagine e l'immagine J, fate clic su Immagine (Image) e selezionate Pile (Stacks) e Progetto Z (Z Project) dal menu a discesa. Quindi, immettete i numeri di sezione da una alla fetta finale e in Tipo proiezione selezionare Intensità media e fare clic su Ok.
Per valutare il tasso di diffusione della cartilagine del vettore peptidico cationico non di equilibrio, assemblare ogni metà della camera di trasporto, per includere una grande guarnizione in gomma, un inserto in polimetilmetacrilato e una piccola guarnizione in gomma. Misurare lo spessore di un'espianto di cartilagine, quindi posizionare l'espianto nei pozzi dell'inserto di plastica con la superficie superficiale rivolta verso la camera a monte e mettere insieme le due metà per completare l'assemblaggio. Utilizzare una chiave inglese per avvitare strettamente le metà prima di riempire la camera a monte con due millilitri di inibitore della proteasi integrato PBS.
Controllare la camera a valle per verificare la presenza di perdite dalla camera a monte. Se non viene rilevata alcuna perdita, riempire la camera a valle con due millilitri di inibitore della proteasi integrato PBS. Aggiungere una singola barra mini agitazione sia alle camere su che a valle e posizionare la camera su una piastra di agitazione con la camera allineata in modo che il laser dello spettrofotometro sia focalizzato verso il centro della camera a valle.
Con la parte del ricevitore del segnale dello spettrofotometro dietro la camera a valle, raccogliere letture stabili e in tempo reale dell'emissione di fluorescenza a valle per almeno cinque minuti. Dopo aver ottenuto una lettura stabile, aggiungere un volume pre-calcolato di soluzione di supporto peptidico cationico etichettato fluorescentmente alla camera a monte a una concentrazione finale del bagno di tre micromolari e monitorare il segnale fluorescente a valle consentendo al trasporto del soluto di raggiungere un costante aumento della pendenza. Una volta raggiunto uno stato stazionario, trasferire 20 microlitri di soluzione dalla camera a monte alla camera a valle per un test di picco e raccogliere le letture di fluorescenza a valle in tempo reale.
Una carica positiva troppo alta limiterà la penetrazione del soluto alla zona superficiale in quanto il vettore si lega troppo fortemente ai gruppi di aggrecan caricati negativamente della matrice cartilaginea. Al contrario, i portatori che sono in grado di sfruttare le interazioni di carica deboli e reversibili penetrano attraverso la zona profonda del tessuto. Un portatore di farmaci caricato in modo ottimale, tuttavia, non solo penetrerebbe nelle zone profonde del tessuto, ma dimostrerebbe anche un elevato assorbimento intra-tissutale, che può essere determinato utilizzando le misurazioni della fluorescenza del bagno di equilibrio e del peso umido dei tessuti, come mostrato.
Gli esperimenti di trasporto della diffusione del non equilibrio si traducono in una curva generata dai dati con una pendenza in graduale aumento. La parte iniziale della curva rappresenta la diffusione del soluto attraverso la cartilagine quando si verificano interazioni di legame della matrice del soluto. Una volta che i soluti raggiungono la camera a valle, la pendenza della curva aumenta man mano che le letture della fluorescenza aumentano nel tempo.
Questa seconda parte della curva raggiunge quindi una pendenza costante, che rappresenta la diffusione dello stato stazionario. L'intercetta X di una linea tangenziale disegnata nella porzione di stato stazionario della curva indica il tempo necessario per raggiungere la diffusione dello stato stazionario o il ritardo tau. Dopo il trasferimento della soluzione dalla camera a monte a quello a valle, si osserva un picco di fluorescenza, a quel punto l'intensità di fluorescenza stabilizzata può essere utilizzata per correlare la fluorescenza alla concentrazione.
I valori rappresentativi di diffusività effettiva e diffusione dello stato stazionario possono quindi essere calcolati, come indicato. Si noti che la diffusività dello stato stazionario è di due ordini di grandezza superiore alla diffusività effettiva come risultato dell'occupato di tutti i siti di binding basati sulla carica. Pertanto, a questo punto, la diffusione si basa sulle dimensioni e non sulla carica, con conseguente valori di diffusione dello stato stazionario simili tra i PC della stessa dimensione.
Mantenere l'idratazione delle piante e ridurre al minimo l'evaporazione della soluzione durante l'esperimento per prevenire cambiamenti nella morfologia della cartilagine e nella concentrazione della soluzione, rispettivamente, e per garantire un'acquisizione accurata e riproducibile dei dati. Seguendo la progettazione di un portatore di farmaci caricato in modo ottimale, varie tecniche di coniugazione possono essere utilizzate per modificare i farmaci per un maggiore targeting tissutale e per facilitare la valutazione della loro efficacia biologica.
