Questa tecnica consente di dare un'occhiata più da vicino alle singole cellule nel tessuto vivente. Monitorando e manipolando singole cellule, possiamo comprendere meglio la formazione dei tessuti durante lo sviluppo. La dimostrazione visiva di questo metodo consente ai potenziali utenti di decidere se questa tecnica potrebbe essere utile per il loro lavoro.
Inoltre, consente agli utenti di vedere come viene eseguita l'applicazione, che sarebbe difficile da afferrare solo dal testo. Questo protocollo può essere applicato ad ogni tessuto con una superficie valutabile. Abbiamo preso di mira cellule diverse negli stessi tessuti, tessuti diversi nella stessa specie e anche specie diverse.
Quando si tenta questo protocollo, è importante rimanere concentrati e lavorare rapidamente. Tutte le attrezzature devono essere preparate prima di iniziare la dissezione. Iniziare installando il software di autoiniettore e tirando le pipette di microiniezione dai capillari di vetro borosilicato con l'estrattore di micropipette.
Conservare le pipette per un massimo di tre giorni protette dalla polvere. Sciogliere l'agarosio di ampia gamma del 3% utilizzando un forno a microonde. Non lasciare che l'agarosio si solidifichi tenendolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Scongelare un'aliquota a SCM e riscaldare la SIM da 10 a 12 millilitri e 20 millilitri della soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius utilizzando un bagno d'acqua. Mescolare il tracciante fluorescente con le altre sostanze chimiche da iniettare, quindi centrifugare la soluzione di microiniezione a 16.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogli il supernatante e trasferiscilo in un nuovo tubo.
Mantenere la soluzione di microiniezione sul ghiaccio fino all'uso. Utilizzare le teste dagli embrioni di topo E13.5 a E16.5 per preparare fette di tessuto organotipico del telencefalo. Rimuovere la pelle e aprire il cranio con le forcep che si muovono lungo la linea mediana.
Sezionare il cervello embrionale dal cranio aperto e rimuovere le meningi che coprono il tessuto cerebrale a partire dal lato ventrale del cervello. Lasciare l'intero cervello sezionato nella soluzione di Tyrode sul blocco di riscaldamento di 37 gradi Celsius. Versare l'ampia gamma di agarosio fuso in uno stampo di incorporamento usa e getta.
Quando si raffredda a 38-39 gradi Celsius, trasferire con cura fino a quattro cervelli nell'agarosio usando una pipetta Pasteur. Mescolare l'agarosio intorno al tessuto con una spatola o un paio di forcelle dumont numero uno senza toccare il tessuto. Lasciare che l'agarosio si solidifichiamo a temperatura ambiente.
Una volta che l'agarosio si è solidificato, tagliare l'eccesso che circonda il tessuto. Riempire il vassoio buffer con PBS. Orientare il cervello con l'asse caudale rostrale del tessuto perpendicolare al vassoio e tagliare 250 fette di micrometro usando un vibratoma.
Riempire una piastra di Petri di 3,5 centimetri con due millilitri di mezzi prerifatti, quindi utilizzare una pipetta Pasteur in plastica per trasferire da 10 a 15 fette a questo piatto. Al termine, trasferire la piastra di Petri con le fette nell'incubatore di coltura delle fette. Mantenere le fette a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata.
Accendere il computer, il microscopio, la fotocamera del microscopio, i manipolatori, il carro di pressione e il sensore di pressione. Carica l'applicazione facendo clic sul file, avvia l'app.py nella cartella principale scaricata da GitHub e specifica le impostazioni del dispositivo nella schermata popup.
Per evitare intasamenti indesiderati, creare una pressione esterna prima di immergere la pipetta nella soluzione. Far scorrere la barra di pressione di compensazione al 24-45% e fare clic su imposta valori. Quindi, sintonizzare la pressione ruotando la manopola della valvola a pressione meccanica su uno o due PSI come indicato dal sensore di pressione.
Trasferire le fette al centro di una piastra di Petri di 3,5 centimetri contenente due millilitri di SIM preriscaldata, quindi posizionare la piastra di Petri sullo stadio di microiniezione che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius. Caricare la pipetta di microiniezione con 1,4-1,6 microlitri di soluzione di microiniezione utilizzando una pipetta di plastica a punta lunga e inserire la pipetta di microiniezione nel supporto della pipetta. Utilizzando l'ingrandimento più basso al microscopio, mettere a fuoco la fetta e guidare la micropipetta in questo campo visivo in modo che sia focalizzata sullo stesso piano della destinazione della fetta.
Passare l'uscita del microscopio alla fotocamera per visualizzare l'FOV e l'applicazione. Fare clic sul pulsante di ingrandimento in alto a sinistra dell'interfaccia per avviare la calibrazione del dispositivo. Quando una finestra richiede di selezionare l'ingrandimento, selezionare il 10X e premere OK. Il software presuppone che l'obiettivo interno sia 10X.
Rifocalizzare la punta della pipetta utilizzando la ruota micrometrica del microscopio e fare clic sulla punta della pipetta con il cursore. Premere quindi il pulsante 1.1 e premere OK nella finestra popup. La pipetta si muoverà nella direzione y.
Fate clic sulla punta della pipetta e premete il pulsante passo 1.2. Infine, immettete 45 nella casella dell'angolo della pipetta e premete l'angolo impostato. Immettere i parametri desiderati nel pannello dei controlli di microiniezione automatizzati e impostare la velocità sul 100%Al termine, fare clic su imposta valori.
Fate clic sul pulsante dello spigolo di disegno e trascinate il cursore lungo la traiettoria desiderata nella finestra popup per definire la traiettoria di iniezione. Per i neuroni microiniettori, indirizzare il lato basale del telencefalo. Portare la pipetta all'inizio della linea e fare clic sulla sua punta, quindi fare clic sulla traiettoria di corsa per avviare la microiniezione.
Ripetere questo passaggio per ogni piano di iniezione preso di mira. Immergere le fette nella miscela di collagene, quindi trasferire le fette insieme a 200-300 microlitri del collagene in un pozzo di 14 millimetri di un piatto inferiore in vetro da 35 millimetri. Assicurarsi che le fette siano coperte nella minima quantità possibile di collagene, che è la condizione ottimale per i nutrienti e l'assorbimento di ossigeno.
Orientare le fette usando due paia di forcette e incubare la piastra di Petri per cinque minuti a 37 gradi Celsius su un blocco riscaldante per consentire al collagene di solidificarsi. Spostare di nuovo la piastra di Petri nell'incubatore di coltura delle fette per altri 40 minuti, quindi aggiungere due millilitri di SCM pre-riscaldato. Alla fine della coltura, esezionare le fette dall'incubatore di coltura slice e aspirare l'SCM.
Lavare le fette incorporate nel collagene con PBS, quindi aggiungere il 4% di paraformaldeide e lasciare il tessuto a temperatura ambiente per 30 minuti. Spostalo a quattro gradi Celsius per la fissazione notturna. Il giorno successivo, aspirare la soluzione di paraformaldeide e lavare le fette con PBS.
Rimuovere le fette dal collagene usando due paia di forcep al microscopio stereo. Utilizzare un forno a microonde per sciogliere l'agarosio a basso punto di fusione del 3%, quindi versarlo in uno stampo di incorporamento usa e getta e lasciarlo raffreddare a circa 38 o 39 gradi Celsius. Trasferire le fette di tessuto in questo stampo assicurandosi che il lato della buccia della fetta sia rivolto verso l'alto, quindi lasciare raffreddare l'agarosio a temperatura ambiente e solidificarsi.
Tagliare l'agarosio extra che circonda le fette. Orientare il blocco di agarosio per assicurarsi che la superficie di taglio sia parallela alla lama di taglio del vibratomo e tagliare sezioni spesse 50 micrometri. Riempire un piatto da 24 po 'con PBS e trasferire le sezioni in questo piatto utilizzando un pennello a punta fine, quindi eseguire l'immunofluorescenza secondo i protocolli standard.
Immagini rappresentative di cellule progenitrici iniettate con successo e neuroni appena nati sono mostrate qui. Quando vengono iniettate con Dextran Alexa 488, le cellule appaiono completamente riempite con il colorante. La microiniezione automatizzata può fornire una produttività significativamente più elevata rispetto alla microiniezione manuale.
Inoltre, l'etichettatura EDU conferma che la vitalità delle celle non è influenzata dall'automazione. Mantenere la fetta organotipica in coltura consente di seguire la progressione del lignaggio delle cellule microiniettate. La microiniezione in singole cellule staminali neurali fornisce un'eccellente risoluzione a singola cellula.
Pertanto, è stato usato per sezionare la biologia cellulare della progressione delle cellule staminali neurali e della transizione del destino. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'accoppiamento giunzionale nei neuroni appena nati iniettando giallo Lucifero insieme a Dextran A555. Una proporzione di neuroni piramidali appena nati è stata accoppiata attraverso giunzioni di gap ai neuroni vicini, il che è coerente con l'idea che i neuroni immaturi comunichino attraverso la giunzione gap.
Abbiamo usato questa tecnica per studiare la biologia cellulare dello sviluppo cerebrale e dell'evoluzione cerebrale. Abbiamo studiato diversi geni candidati che stavano influenzando il comportamento delle cellule staminali neurali e siamo stati in grado di scoprire e capire come funzionano, come influenzano la progressione del lignaggio delle cellule staminali neurali e la produzione di neuroni durante lo sviluppo cerebrale.
