Gli autori ringraziano Giulio Cossu, Martina Ragazzi e tutto il laboratorio per utili discussioni e supporto, e Jeff Chamberlain per aver gentilmente fornito il vettore MyoD-ER. Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi sono stati completati in conformità e nel rispetto di tutte le agenzie, i regolamenti e le linee guida normative e istituzionali pertinenti. Il lavoro nel laboratorio degli autori è supportato dal Consiglio per la ricerca medica del Regno Unito, dai progetti quadro della Comunità europea Optistem e Biodesign e dal progetto madre italiano Duchenne.

1. Valutazione del potenziale miogenico e di innesto
<ol><li>
In vitro:differenziazione indotta da MyoD<ol>
<li>Generare una linea cellulare stabile di IDEM trasdotti con il vettore lentivirale MyoD-ER inducibile al tamoxifene, che titra la molteplicità dell'infezione (MOI; ad esempio 1, 5 e 50) utilizzando la colorazione descritta al punto 1.1.9 (MyHC) come risultato dell'efficienza della procedura.</li>
		<li>Ricoprire un piatto da 3,5 cm con 1 ml di 1% di Matrigel e incubare per 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lavare il piatto due volte con iDEM trasdotti medium, seme 1 x10 5 MyoD-ER nel piatto di coltura tissutale da 3,5 cm e incubare a 37 °C nel mezzo di crescita.</li>
		<li>Aspettatevi che le cellule raggiungano la confluenza in uno o due giorni e quindi aggiungete 1 μM 4OH-tamoxifene nel mezzo di crescita (1dose di st).</li>
		<li>Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di crescita con un mezzo di differenziazione integrato con 1 μM 4OH-tamoxifene(2 nd e ultima dose).</li>
		<li>Sostituire metà del mezzo con un mezzo di differenziazione fresco a giorni diversi.</li>
		<li>Esamina quotidianamente le culture per la formazione di miotubi.</li>
		<li>Dopo una settimana (5 giorni in mezzo di differenziazione), lavare delicatamente le piastre con PBS e fissare con paraformaldeide al 4 % per 5 minuti a RT.</li>
		<li>Eseguire una colorazione immunofluorescenza con anticorpi contro la catena pesante della miosina (MyHC) per confermare la presenza di miotubi. Controsostenimento con uncolorante nucleare (ad esempio Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>L'efficienza della differenziazione viene valutata come percentuale di nuclei all'interno delle cellule positive myhc: procedere al passaggio successivo se l'efficienza è >50%.
<ol start="2"><li>
In vivo: innesto in un modello di rigenerazione muscolare acuta Per valutare il contributo in vivo degli IDEM MyoD-ER alla rigenerazione muscolare, le cellule sono precedentemente etichettate con una codifica vettoriale per la proteina fluorescente verde (GFP) che consentirà di rintracciarle all'interno del tessuto. Gli IDEM MyoD-ER GFP vengono quindi iniettati nei muscoli murini adulti, precedentemente feriti con una miotoxina(ad esempio cardiotossina). Per evitare il rigetto immunitario contro cellule xenogeneiche (come HIDEM) o geneticamente manipolate / corrette è necessario utilizzare topi immunodifesa o immunosoppressi.<ol>
<li>Pretrattare gli animali con un'iniezione intra-peritoneale di 3,5 μl/g di 10 mg/ml di tamoxifene (forma liposolubile) 24 ore prima del trapianto e delle cellule pretrattate aggiungendo 1 μM 4OH-tamoxifene (forma acquosa) nel mezzo di crescita durante la notte prima del giorno del trapianto.</li>
		<li>Somministrare anestesia e analgesia al topo seguendo le linee guida specifiche che regolano le procedure chirurgiche nella struttura animale.</li>
		<li>Iniettare 25 μl di cardiotossina 100 μM (CTX; da Naja mossambica mossambica; ATTENZIONE: sostanza potenzialmente dannosa) nei muscoli anteriori (TA) tibiali.</li>
		<li>24 ore dopo aver trattato gli animali con tamoxifene e CTX, staccare le cellule per tripsicinazione e conteggio.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 232 x g per 5 min.</li>
		<li>Lavare il pellet cellulare in PBS privo di Ca2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere delicatamente il pellet cellulare in CA2+- e Mg2+-free PBS a una concentrazione finale di 106 cellule / 30 μl, che sarà il volume finale di ogni iniezione.</li>
		<li>Iniettare 30 μl di sospensione cellulare nei muscoli precedentemente feriti usando una siringa con ago da 29 o 30 G. Prestare particolare attenzione durante la rimozione dell'ago dal muscolo. Fallo lentamente, evitando di versare la sospensione cellulare attraverso la pista dell'ago. Non trapiantare l'TA contralaterale e utilizzarlo come controllo, iniettando 30 μl di PBS privo di Ca2+   e Mg2+per replicare le condizioni di quello trapiantato.</li>
		<li>Trattare gli animali con tamoxifene per altri sei giorni e somministrare l'analgesia(ad esempio Carprofen) per altri due giorni.</li>
		<li>Espiantare i muscoli da 14 giorni dopo il trapianto in poi. Elaborare e analizzare i campioni come descritto nei protocolli 4 e 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Trapianto in modelli di topo di distrofia muscolare
Questo test di trapianto consente di valutare l'entità dell'innesto degli IDEM nei modelli di topo di distrofia muscolare. Gli animali, trattati come segue, possono anche essere valutati per il miglioramento funzionale del fenotipo della malattia. I test funzionali possono essere eseguiti a partire da due settimane dopo il trapianto. Al fine di migliorare l'innesto, prendere in considerazione l'esecuzione di esercizi di tapis roulant pretrapianto (come descritto nel protocollo 3)e/o iniezioni di cellule seriali ogni tre settimane per 3x (cioè per un totale di 3 iniezioni/muscoli).
<ol><li>Trapianto intramuscolare<ol>
<li>Pretrattare gli animali con un'iniezione intra-peritoneale di 3,5 μl/g di 10 mg/ml di tamoxifene (formulazione liposolubile) 24 ore prima del trapianto e delle cellule pretrattate aggiungendo 1 μM 4OH-tamoxifene (formulazione acquosa) nel mezzo di crescita durante la notte prima del giorno del trapianto.</li>
		<li>Staccare per tripsicinazione, contare e centrifugare le cellule a 232 x g per 5 min.</li>
		<li>Lavare il pellet cellulare in PBS privo di CA2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere il pellet in CA2+- e Mg2+-free PBS a una concentrazione di 106 cellule/30 μl.</li>
		<li>Somministrare analgesia e disinfettare la pelle dell'animale (facoltativo) con un disinfettante a base di iodio povidone o cloridodidina. Questo aiuterà anche a localizzare i muscoli tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) e quadriceps femoris (QC; in particolare il vastus intermedius).</li>
		<li>Iniettare 30 μl di sospensione cellulare nei muscoli usando una siringa con ago da 29 o 30 G. Per il TA, inserire 5 mm dell'ago 2 mm sotto l'inserimento del tendine prossimale (direzione craniocaudale) con un'inclinazione di 15° rispetto alla tibia e iniettare lentamente la sospensione cellulare mentre si ritrae l'ago (svuotare la siringa con 2 mm dell'ago ancora all'interno del muscolo). Per il GC e il QC, ripetere la stessa procedura dettagliata per il TA, con la differenza principale è l'inserimento caudocranica dell'ago 2 mm sopra la giunzione miotendinosa del tendine d'Achille per il GC e 2 mm sopra il tendine distale per il QC (inclinazione di 15° rispetto al femore). Prestare attenzione mentre si rimuove l'ago dal muscolo per evitare di versare la sospensione cellulare attraverso la pista dell'ago. RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: In caso di basso innesto prendere in considerazione l'iniezione di topi giovani (1-2 settimane)7 con 3 x 105 cellule / 10 μl (si noti che in questo caso il tamoxifene deve essere somministrato per via sottocutanea).</li>
	</ol></li>
	<li>Trapianto intra-arterioso Questa parte del protocollo consente la valutazione della capacità dei MIDEM e dei HIDEM di essere erogata nella circolazione arteriosa, attraversare la parete del vaso e contribuire alla rigenerazione muscolare scheletrica nei muscoli a valle del sito di iniezione.<ol>
<li>Pretrattare animali e cellule come descritto sopra nella fase 2.1.1.</li>
		<li>Staccare per tripsicinazione e filtrare con un filtro cellulare da 40 μm (per rimuovere i cluster dalla sospensione cellulare nell'improbabile caso in cui l'esposizione notturna al tamoxifene possa guidare la fusione e la formazione di miotubi dalle cellule adiacenti) contare e centrifugare le cellule a 232 x g per 5 minuti</li>
		<li>Lavare il pellet cellulare in PBS privo di CA2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere il pellet in CA2+- e Mg2+-free PBS con 0.2 International Unità di eparina di sodio (facoltativa) ad una concentrazione cellulare finale di 106 cellule/50 μl. Aggiungere alla soluzione colorante blu brevettato al 10% (concentrazione finale: 1,25 mg/ml in soluzione salina normale o Ca2+- e Mg2+-free PBS) al fine di visualizzare la distribuzione della sospensione cellulare.</li>
		<li>Somministrare anestesia e analgesia al topo secondo le linee guida che regolano le procedure chirurgiche nello specifico impianto animale istituzionale.</li>
		<li>Radere la regione inguinale ( conosciamo anche come femorale o triangolo di Scarpa) e disinfettare la pelle con un disinfettante a base di iodio povidone o clorexidina.</li>
		<li>Fai un'incisione di 5-7 mm e localizza il fascio femorale: vena, arteria e nervo (il nervo si sdraia lateralmente all'arteria e alla vena medialmente).</li>
		<li>Rimuovere delicatamente la fascia connettiva che copre il fascio con forcep.</li>
		<li>Separare la vena femorale e il nervo dall'arteria introducendo delicatamente la punta di una pinga (o un ago da 30 G) tra di loro e allargando progressivamente il foro. RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: La vena femorale è fragile: prestare attenzione a non pizzicarla con le forcep durante il suo distacco dall'arteria femorale. In caso di emorragia, scolare il sangue con garza sterile e utilizzare un micro cauterizzatore per facilitare l'emostasi.</li>
		<li>Sollevare l'arteria con una punta delle pinze e bloccare l'arteria con l'altra punta.</li>
		<li>Forare l'arteria con una siringa dotata di un ago da 30 G. Iniettare 50 μl di sospensione cellulare a valle dell'area bloccata, ad una velocità di infusione di circa 5 μl/sec. RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: Risospendare con cura le cellule nella siringa prima dell'iniezione: è fondamentale evitare la precipitazione delle cellule e la formazione di bolle d'aria all'interno della siringa. Il diametro dell'arteria femorale è leggermente inferiore a un ago da 30 G: fare attenzione a non troncare l'arteria mentre si inserisce l'ago. La tintura blu brevettata consente di riconoscere l'efficacia dell'iniezione: se correttamente iniettata, l'intero arto diventerà rapidamente azzurro.</li>
		<li>Rimuovere lentamente l'ago e le pinai dall'arteria per ripristinare il flusso sanguigno nell'arto.</li>
		<li>Applicare pressione con garza sterile per evitare sanguinamento e/o cauterizzare a richiesta.</li>
		<li>Suturare la ferita e monitorare gli animali fino al recupero dall'anestesia.</li>
		<li>Somministrare l'analgesia per 3 giorni e ispezionare la ferita ogni giorno (in caso di infezione da ferita discuterne con il personale della struttura animale e somministrare antibiotici come richiesto).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Misure di esito sugli animali distrofici trapiantati: test del tapis roulant
A partire da due settimane dopo il trapianto di cellule, è possibile valutare il miglioramento funzionale della capacità motoria dei topi trattati con i test del tapis roulant. Questo test consente la valutazione della tolleranza/resistenza all'esercizio fisico dei topi trattati. Un topo è considerato affaticato quando si trova nell'area di riposo per più di 5 secondi, senza tentare di riimpiegnare il tapis roulant dopo una serie di 3 stimoli meccanici consecutivi (uno ogni 5 secondi). Le misurazioni di base iniziano circa un mese prima del trattamento e vengono utilizzate per valutare il miglioramento di ogni singolo animale testato. Questo test può essere seguito da ulteriori test per monitorare la fragilità della fibra, il miglioramento della forza, l'innesto, la differenziazione delle cellule trapiantate e l'miglioramento morfologico dei muscoli trapiantati (vedi Discussione).
<ol><li>Acclimatare gli animali (di solito tre gruppi: controlli di tipo trattato, non trattati e selvatici / non distrofici) all'esercizio prima della prima misurazione: impostare il tapis roulant a una velocità di 6 m / min per 10 minuti. Ripetere la procedura a giorni diversi per una settimana. RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: Registrare tutte le misurazioni alla stessa ora del giorno per evitare distorsioni dovute ai cicli circadiani.</li>
	<li>Posizionare gli animali nel tapis roulant, che è stato precedentemente impostato con un'inclinazione di 10°.</li>
	<li>Accendere il tapis roulant, con una velocità di partenza di 6 m/min (fornire un delicato stimolo meccanico nel caso in cui gli animali non siano disposti ad iniziare l'esercizio).</li>
	<li>Avviare il timer e aumentare la velocità 2 m / min ogni 2 minuti.</li>
	<li>Non appena un animale giace nell'area di riposo per più di 5 secondi senza tentare di riimpiecare il tapis roulant, toccarlo delicatamente con un bastone per stimolare il riavvio dell'esercizio (vedi sopra).</li>
	<li>Registrare le prestazioni (tempo e o distanza) di ogni animale.</li>
	<li>Ripetere le misurazioni settimanalmente o ogni 10 giorni per almeno 3 volte.</li>
	<li>Ripetere la stessa procedura dopo il trapianto.</li>
	<li>Analizza i dati sulle prestazioni confrontando la misurazione di ogni animale con le sue prestazioni di base. Si consiglia di tracciare i valori in un grafico come percentuale della capacità motoria media rispetto al basale e di analizzarli mediante un test ANOVA a uno o due modi seguito da un post-test appropriato per confrontare i gruppi.</li>
</ol>RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: utilizzare almeno 5 animali/gruppi di età, genotipo e sesso e ripetere le misurazioni per almeno 3 volte dopo il trapianto.
4. Valutazione dell'innesto cellulare e differenziazione nei muscoli trapiantati
I muscoli trapiantati e di controllo vengono raccolti nel momento appropriato (<2 giorni per l'analisi dell'innesto a breve termine, 2-3 settimane per il medio termine e >1 mese per l'analisi a lungo termine). Se le cellule trapiantate sono etichettate con GFP, l'innesto nei muscoli appena isolati può essere valutato mediante fluorescenza diretta sotto uno stereomicroscopio dotato di UV.
<ol><li>Posare e orientare lungo l'asse verticale muscoli appena isolati nella gomma tragachanth (6% w/v)</li>
	<li>Disidratare i campioni in isopentane prechilled per un minuto, congelarli in azoto liquido per almeno 2 minuti e posizionarli immediatamente a -80 °C per la conservazione.</li>
	<li>Elaborare i campioni con un criostato per ottenere sezioni spesse 7 μm su diapositive polarizzate. Campionare la maggior parte del muscolo sulle diapositive, raccogliendo circa 8-10 diapositive con 30-40 sezioni / scivolo. Si consiglia di raccogliere una serie di sezioni in un tubo da 1,5 ml per eseguire test di biologia molecolare / biochimica.</li>
	<li>Valutare l'innesto cellulare con diverse colorazioni immunofluorescenti, a seconda della configurazione sperimentale. Ad esempio, in caso di trapianto HIDEM in topi Sgca-null/scid/bg, sezioni di macchia con: a) un anticorpo contro Lamin A/C per rilevare nuclei cellulari umani innestati; b) un anticorpo contro Laminin per visualizzare la struttura complessiva del muscolo; e c) un anticorpo contro Sgca per rilevare il ripristino della proteina assente nell'animale distrofo.</li>
	<li>Quantificare, utilizzando un microscopio a fluorescenza, il numero di nuclei donatori per sezione muscolare all'interno e all'esterno delle fibre muscolari e il numero di miofibre scheletriche derivate dal donatore per sezione.</li>
</ol>5. Istopatologia muscolare
Le analisi istopatologiche consentono la valutazione della struttura morfologica del muscolo trapiantato. Il miglioramento architettonico della struttura tissutale è previsto come risultato dell'approccio di terapia cellulare.
<ol><li>Fissare i muscoli appena isolati con paraformaldeide al 4% per 1 ora a 4 °C.</li>
	<li>Disidratare i campioni con un gradiente crescente di saccarosio(ad esempio 7,5-15-30% w/v).</li>
	<li>Lasciare i muscoli durante la notte nella soluzione di saccarosio più alta.</li>
	<li>Incorporare i campioni in Tissue Tek OCT, metterli in isopentane prechilled fino a quando lo OCT diventa solido (evitando l'immersione completa dei campioni), congelarli in azoto liquido per almeno 2 minuti e posizionarli immediatamente a -80 °C per la conservazione.</li>
	<li>Elaborare i campioni con un criostato per ottenere sezioni spesse 7 μm come descritto sopra.</li>
	<li>Macchiare le sezioni con ematossilina ed eosina o tricromo di Masson secondo i protocolli standard del produttore.</li>
</ol>La colorazione di ematossilina ed eosina consente di calcolare i tratti distintivi del muscolo rigenerante, come: a) il numero di miofibre; b) area di sezione trasversale; e) il numero di miofibre contenenti un nucleo centrale. Il tricromo di Masson viene utilizzato per calcolare l'indice fibrotico, fatto sottraendo l'area totale occupata dalle miofibre scheletriche dall'area totale dell'immagine: l'area risultante riflette principalmente l'infiltrato connettivo e grasso del muscolo. Tutte le analisi sulle immagini potrebbero essere eseguite utilizzando il software ImageJ (NIH) con lo strumento di misurazione e il plug-in del contatore delle celle.

<ol>
	<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li><li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meso-angioblast:+a+multipotent,+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues.">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+of+alpha-sarcoglycan+null+dystrophic+mice+through+intra-arterial+delivery+of+mesoangioblasts.">Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts.</a> Science. 301, 487-492 (2003).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs.">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy.">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy.">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 3, (2011).</li><li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies.">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies:+validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+Duchenne+muscular+dystrophy+cells.">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells.</a> Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).</li><li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-lineage+regulated+myogenesis+for+dystrophin+replacement:+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+muscular+dystrophy.">Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+past,+present,+and+future.">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li><li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li></ol>

F.S.T. ha presentato una domanda di brevetto internazionale (n. PCT/GB2013/050112) inclusa parte della strategia descritta in questo articolo. Ha ricevuto finanziamenti da Promimetic e DWC ltd. per la sua ricerca.

Gli iPSC possono essere espansi indefinitamente preservando il loro potenziale di auto-rinnovamento e quindi essere diretti a differenziarsi in un'ampia gamma di lignaggicellulari 12. Per questo e altri motivi le cellule staminali/progenitrici derivate da iPSC sono considerate una fonte promettente per gli approcci autologi di terapia genica e cellulare13. Un lavoro pubblicato in precedenza dagli Autori ha riportato la generazione di progenitori miogenici di topi e umani da iPSC con un fenotipo simi...

I mesoangioblasti (MAB) sono progenitori muscolari associati ai vasi derivati da un sottoinsieme di periciti1-3. Il principale vantaggio dei MAB rispetto ai progenitori muscolari canonici come le cellule satellitari4 risiede nella loro capacità di attraversare la parete del vaso quando vengono consegnati intra-arteriosamente e quindi contribuire alla rigenerazione muscolare scheletrica nei protocolli di terapia cellulare. Questa caratteristica è stata valutata e confermata sia nei modelli murini che canini di distrofiamuscolare 1,5,6. Questi studi preclinici hanno gettato le basi per uno studio clinico di fase I/II del primo uomo basato sul trapianto intra-arterioso di MAB identici all'HLA del donatore nei bambini con distrofia muscolare di Duchenne (EudraCT n. 2011-000176-33; attualmente in corso all'Ospedale San Raffaele di Milano, Italia). Uno dei principali ostacoli degli approcci di terapia cellulare, in cui sono necessari miliardi di cellule per trattare il muscolo di un intero corpo, è il limitato potenziale proliferatore del "medicinale" (le cellule). Inoltre è stato recentemente dimostrato che non è possibile ottenere MAB da pazienti affetti da alcune forme di distrofia muscolare, come si verifica nella distrofia muscolare degli arti-cintura 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Per superare questi limiti, è stato recentemente istituito un protocollo per derivare cellule staminali/progenitrici simili a MAB da IPSC umani emurini 7. Questa procedura genera popolazioni cellulari facilmente espandibili con una firma genica vascolare e immunofenotipo altamente simile ai MAB derivati dai muscoli adulti. Dopo l'espressione del fattore regolatore miogenico MyoD, sia gli IDEM murini che umani (rispettivamente MIDEM e HIDEM) subiscono una differenziazione muscolare scheletrica terminale. Per raggiungere questo obiettivo gli IDEM possono essere trasdotti con vettori in grado di guidare l'espressione MyoD, in modo costitutivo o inducibile8-10. Viene utilizzato un vettore lentivirale contenente MyoD cDNA fuso con il recettore degli estrogeni (MyoD-ER), consentendo così la sua traslocazione nucleare su somministrazione di tamoxifene (un analogo estrogenico)11. Questa strategia si traduce nella formazione di miotubi ipertrofi multinucleati, ad alta efficienza7. In particolare, gli IDEM non sonotumorigeni, possono innestarsi e differenziare i muscoli ospiti al momento del trapianto e possono essere geneticamente corretti utilizzando diversi vettori(ad esempio lentivirus o cromosomi artificiali umani), aprendo la strada a future strategie terapeutiche autologhe. La derivazione, la caratterizzazione e il trapianto di IDEM sono stati descritti nella pubblicazione 7 di cuisopra. Questo documento di protocollo descrive in dettaglio i test eseguiti per valutare la differenziazione miogenica in vitro degli IDEM e le successive misurazioni dei risultati per testare l'efficacia del loro trapianto nei modelli di topo di rigenerazione muscolare.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaCell DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0090L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Calcium/Magnesium free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutammine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilline/Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fer-In-Sol</td>
			<td>Mead Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferlixit</td>
			<td>Aventis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01257-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5900-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bFGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grow factors-reduced Matrigel</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium heparin</td>
			<td>Mayne Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19, 821-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OH Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9759</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragachant gum</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopenthane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24,872,323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s trichrome</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-010802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Lamin A/C antibody</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NLC-LAM-A/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4/11/13</td>
			<td>Cappel</td>
			<td>559762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma fluka</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Laminin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MATERIALS AND EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adsorbable antibacteric suture 4-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>vcp310h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill</td>
			<td>Columbus instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane unit</td>
			<td>Harvad Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optics</td>
			<td>Euromecs (Holland)</td>
			<td>EK1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>C17A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>11REF050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td></td>
			<td>5/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature cauteriser</td>
			<td>Bovie Medical</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEDIA COMPOSITION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media composition is detailed below. 
			HIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>MegaCell Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li>
				<li>5% fetal bovine serum (FBS)</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% non essential amino acids</li>
				<li>5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in:
			<ul>
				<li>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</li>
				<li>10 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% Non essential amino acids (NEAA)</li>
				<li>1% ITS (insulin / transferrin / selenium)</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>0.5 &#956;M oleic and linoleic acids</li>
				<li>1.5 &#956;M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li>
				<li>0.12 &#956;M Fe3+ (Ferlixit)</li>
			</ul>
			MIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>20 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Differentiation medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>2 % Horse Serum (HS)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
			</ul>
			 
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.

transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration

Gli iPSC derivati dal paziente potrebbero essere una fonte inestimabile di cellule per i futuri protocolli di terapia cellulare autologa. Le cellule staminali/progenitrici miogeniche derivate da iPSC simili ai mesoangioblasti derivati dai periciti (cellule staminali/progenitrici simili a mesoangioblasti derivate da iPSC: IDEM) possono essere stabilite da iPSC generati da pazienti affetti da diverse forme di distrofia muscolare. Gli IDEM specifici del paziente possono essere corretti geneticamente con diversestrategie (ad esempio vettori lentivirali, cromosomi artificiali umani) e potenziati nel loro potenziale di differenziazione miogenica dopo l'iperespressione del regolatore di miogenesi MyoD. Questo potenziale miogenico viene quindi valutato in vitro con specifici saggi di differenziazione e analizzato per immunofluorescenza. Il potenziale rigenerativo degli IDEM viene ulteriormente valutato in vivo, su trapiantointramuscolare e intra-arterioso in due modelli rappresentativi di topo che mostrano rigenerazione muscolare acuta e cronica. Il contributo degli IDEM al muscolo scheletrico ospite è quindi confermato da diversi test funzionali nei topi trapiantati. In particolare, il miglioramento della capacità motoria degli animali viene studiato con prove sul tapis roulant. L'innesto e la differenziazione cellulare vengono quindi valutati da una serie di test istologici e immunofluorescenza sui muscoli trapiantati. Nel complesso, questo documento descrive i saggi e gli strumenti attualmente utilizzati per valutare la capacità di differenziazione degli IDEM, concentrandosi sui metodi di trapianto e sulle successive misure di risultato per analizzare l'efficacia del trapianto cellulare.

I risultati rappresentativi riportati seguono i principali saggi in vitro/in vivo descritti nel flusso di lavoro nella figura 1. 48 ore dopo la somministrazione di 4OH-tamoxifene I nuclei mioD-positivi sono identificabili all'interno degli IDEM trasdotti MyoD-ER incoltura (Figura 2A). Le celle si fondono e si differenziano quindi in miotubi multinucleati (Figura 2B). Se trapiantati per via intramuscolare in un modello murino di lesione muscolare acuta, gli IDEM ...

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration at JoVE.com

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Views.  University College London. I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Video: Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

L&#39;uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Ricerca

Bioingegneria

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney disease and eventual end-stage renal failure are often caused by the damage to the glomerular podocytes, which are the highly specialized epithelial cells that function together with endothelial cells and the glomerular basement membrane to form the kidney&#8217;s filtration barrier. Advances in renal medicine have been hindered by the limited availability of primary tissues and the lack of robust methods for the derivation of functional human kidney cells, such as podocytes. The ability to derive podocytes from renewable sources, such as stem cells, could help advance current understanding of the mechanisms of human kidney development and disease, as well as provide new tools for therapeutic discovery. The goal of this protocol was to develop a method to derive mature, post-mitotic podocytes from human induced pluripotent stem (hiPS) cells with high efficiency and specificity, and under chemically defined conditions. The hiPS cell-derived podocytes produced by this method express lineage-specific markers (including nephrin, podocin, and Wilm&#8217;s Tumor 1) and exhibit the specialized morphological characteristics (including primary and secondary foot processes) associated with mature and functional podocytes. Intriguingly, these specialized features are notably absent in the immortalized podocyte cell line widely used in the field, which suggests that the protocol described herein produces human kidney podocytes that have a developmentally more mature phenotype than the existing podocyte cell lines typically used to study human kidney biology.

Presented here is a chemically defined protocol for the derivation of human kidney podocytes from induced pluripotent stem cells with high efficiency (&#62;90%) and independent of genetic manipulations or subpopulation selection. This protocol produces the desired cell type within 26 days and could be useful for nephrotoxicity testing and disease modeling.

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Generazione, screening ad alto rendimento e biobanca di sferoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...