A.J.C, J.A.T e I.L riconoscono il finanziamento della Commissione Europea tramite il progetto Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z riconosce il finanziamento del dottorato di ricerca dal China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R riconosce il sostegno finanziario del programma di sovvenzioni Vidi dell'Organizzazione olandese della ricerca scientifica (NWO Vidi 723.0160330).

L'uso di biofluidi umani è stato approvato secondo le linee guida del protocollo IRB dell'Università di Leida e dell'Università di Medicina di Innsbruck. Quando si studiano biofluidi umani o animali, è necessaria l'approvazione etica da parte dell'istituto di ricerca ed è stata ottenuta nel caso dei risultati mostrati in questo protocollo. Inoltre, dovrebbero essere effettuate relazioni adeguate per garantire la trasparenza e la riutilizzabilità dei dati nei futuri lavori9,29,30.
1. Preparazione di elettroliti di fondo (BGE)
NOTA: Tutti i solventi devono essere preparati in un'adeguata cappa aspirante e devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale per tutte le fasi (labcoat, guanti e occhiali). In ogni fase, sono necessari flaconcini di plastica a bassa legatura per ridurre al minimo la perdita di analita e la contaminazione del campione con sali lisciviati dalla vetreria.
<ol><li>Preparare il 10% di acido acetico BGE (v / v), pH 2,2 su base giornaliera per la metabolomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 1 mL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua deionizzata (DI) alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 100 mM di acido acetico, pH 2,9 su base giornaliera per la proteomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 57 μL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua DI alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione NM
<ol><li>Disperdere vigorosamente i NG in acqua utilizzando le linee guida pubblicate31,32,33. NOTA: Nello sviluppo di questo protocollo, sono stati utilizzati 7 NM come segue: 100 e 1.000 nm di polistirene carbossilato sono stati utilizzati rispettivamente per la proteina e il metabolita corona. 100 nm di POLISTIRENE NON MODIFICATO NMs, 13 nm anatasi TiO2 NM che erano non modificati o rivestiti con polimeri poliacrilati o PVP e 22 nm non modificato SiO2 NM nMs sono stati utilizzati sia per le corone proteiche che per i metaboliti. Mentre il metodo è stato sviluppato e dimostrato utilizzando questi NM, va notato che questo approccio sarebbe applicabile per una vasta gamma di composizioni, dimensioni, forme e morfologie NM.</li>
	<li>Caratterizzare la dimensione delle particelle utilizzando la diffusione dinamica della luce34,35,la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente a singola particella36,l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle37o la microscopia elettronica a trasmissione e la carica superficiale come potenziale zeta utilizzando un zeta sizer34.</li>
</ol>3. Formazione di corona biomolecolare
<ol><li>Dividere 2 mL di plasma umano (o biofluido a scelta) in aliquote da 1 mL, una per il metabolita e la proteina corona e la seconda per la caratterizzazione del metaboloma plasmatico.</li>
	<li>Incubare 1 mg/mL di NMs nel plasma umano per 1 ora a 37 °C mescolando delicatamente a 500 rpm in un bimbyxer. Dopo l'incubazione centrifugare il campione a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le RM.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante plasmatico per l'analisi del metabolita corona. Mantenere il complesso corona NM-proteina per la caratterizzazione della corona proteica.</li>
</ol>4. Isolamento della corona proteica
<ol><li>Risospendare il complesso NM-proteina (il pellet) in 1 mL di 10x PBS Buffer e vortice vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate. Centrifugare la soluzione PBS a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le NN e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Risospendare il pellet in 1 mL di tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) (100 mM, pH 8,0) e vortici vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate e i sali indesiderati. Centrifugare a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare i NN; rimuovere ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Ridurre i legami disolfuro proteico sciogliendo il pellet di proteina NM in 20 μL di tampone ABC (100 mM pH 8) contenente 10 mM di ditioteritolo. Incubare la soluzione di riduzione per 30 minuti a 56 °C.</li>
	<li>Per digerire le proteine, aggiungere 2 μg di tripsina di grado sequenziale a 20 μL di ABC contenente lo 0,1% di tensioattivo. Incubare la soluzione digestiva per 16 ore a 37 °C.</li>
	<li>Alchilare il campione con l'aggiunta di 20 μL di iodoacetammide a 55 mM in 100 mM ABC e incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di 0,1 M HCl per fendere il tensioattivo e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Arricchire e desalt peptidi utilizzando una punta della pipetta dissalatrice confezionata C18.<ol>
<li>Bagnare la punta con 80 μL 0,1% acido formico 50% acetonitrile 5 volte, pulire con 80 μL 0,1% acido formico 5 volte, prelevare ed eluire il campione 10 volte, desaltare il campione lavando 80 μL 0,1% acido formico 5 volte ed eluire il campione 2 volte con 80 μL 0,1% acido formico 70% acetonitrile in un tubo PCR pulito a bassa legante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizzare i campioni e conservare a -20 °C fino all'analisi.</li>
</ol>5. Isolamento del metabolita corona
<ol><li>Prendere il plasma di controllo e il surnatante dall'incubazione del plasma NM dalla fase 3.3 e mantenere il ghiaccio durante la preparazione del campione.</li>
	<li>Prendere 50 μL da ciascuno in flaconcini separati e diluire 1 su 10 con acqua DI. Prendere 50 μL di ciascun campione diluito e passare a nuovi flaconcini per il passaggio 5.3.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di cloroformio, 250 μL di metanolo e 350 μL di acqua DI e una miscela vigorosamente a vortice per 2 min. Centrifuga per 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Prendere 500 μL di surnatante e filtrare attraverso un filtro centrifugo da 3 kDa per 2 ore a 10.000 x g a 4 °C. Prendere 430 μL di ultrafiltrato e asciugare in una velocità vac. I campioni possono ora essere congelati prima dell'analisi.</li>
</ol>6. Preparazione del sistema CESI-MS38
NOTA: Prima dell'installazione dei capillari, controllare che l'ingresso e l'estremità di uscita dei capillari siano intatti e che non vi siano rotture visibili nel capillare.
<ol><li>Installazione di un capillare rivestito neutro per l'analisi della corona proteica39.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare rivestito neutro (lunghezza 90 cm con diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di capillari CESI per analisi proteomiche.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando 100 mM di HCl per 5 minuti a 100 psi e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Separazione capillare a filo con BGE a 100 psi per 10 min e poi acqua DI a 100 psi per 30 min (questo è richiesto solo per i nuovi capillari).</li>
		<li>Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'estremità di uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M HCl, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia CESI alla SM utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installazione di capillare di silice fusa nuda per la caratterizzazione della corona del metabolita38.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare di silice fusa nuda (lunghezza 90 cm con un diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei capillari CESI per l'analisi metabolomica.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando MeOH al 100% a 50 psi per 15 minuti e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M NaOH, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia cesio all'ESI-MS utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza. 38 anni
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS per l'analisi della corona proteica
<ol><li>Sospendare i campioni dallo step 4.8 in 20 μL di 50 mM di acetato di ammonio pH 4.0.</li>
	<li>Eseguire l'iniezione idrodinamica 5 psi 10 s del campione. Separare utilizzando una tensione di separazione di 30 kV con il seguente gradiente di pressione: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1,5 psi e 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2,9 acido acetico come BGE.</li>
	<li>Raccogli spettri di massa tra 250-2000 m/z con l'acquisizione di frammentazione dipendente dai dati top-10.</li>
	<li>Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl per 3 min a 100 psi e 10 min 100 psi di BGE per la separazione capillare e per 3 min a 100 psi per il liquido conduttivo capillare.</li>
</ol>8. CESI-MS per l'analisi del metabolita corona
NOTA: Tutti i campioni devono essere analizzati due volte, una volta in modalità positiva per il rilevamento dei cationi e una volta in modalità negativa per la rilevazione degli anioni. I campioni di plasma di controllo devono essere analizzati almeno 5 volte.
<ol><li>Sospendare i campioni di plasma esposti e non esposti al NM dal passo 5.4 in 430 μL di acqua DI e vortice vigoroso per 2 min. Filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,1 μm.</li>
	<li>Prendere 95 μL di filtrato e aggiungere 5 μL di standard interni a 200 μM per i cationi (L-metionina solfone) e 400 μM per gli anioni (acido 2,2,4,4-D4-citrico) e vortice vigorosamente. Centrifugare a 4.000 x g a 4 °C per 10 minuti prima dell'analisi CESI-MS.</li>
	<li>Iniettare il campione idrodinamicamente per 30 s (cationi) e 40 s (anioni) a 2 psi.</li>
	<li>Separare i metaboliti in acido acetico al 10% con una tensione di separazione di 30 kV in modalità avanti (cationi) e inversa (anioni). La modalità di separazione inversa è assistita da una pressione in avanti di 0,5 psi sul capillare di separazione.</li>
	<li>Impostare lo spettrometro di massa per raccogliere dati in modalità positiva (cationi) o negativa (anioni) nell'intervallo di massa 65-1000 m/z. Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, acqua DI e BGE a 50 psi per 2 min.</li>
</ol>

J.A.T è un dipendente di AB Sciex UK Ltd che partecipa come partner industriale al progetto ACEnano, J.A.T e tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse in questo lavoro.

Questo è il primo metodo proposto per caratterizzare la corona biomolecolare completa incorporando proteine e metaboliti, dallo stesso campione, utilizzando CESI-MS. La capacità di caratterizzare sia le proteine che i metaboliti dello stesso campione aumenterà significativamente la quantità di dati raccolti da una singola esposizione sperimentale consentendo nuove informazioni sul processo di formazione della corona e sui suoi impatti per la tossicità e l'efficacia delle NN come nanofarmaci. Inoltre, CESI-MS è una piattaforma ideale per caratterizzare entrambe le classi di biomolecole con un solo cambio di capillare richiesto. Andando avanti, nuovi metodi sviluppati per la CE non acquosa consentiranno di eseguire la lipidomica utilizzando CE-MS40, quindi è ora possibile analizzare proteine, metaboliti e lipidi utilizzando un'unica piattaforma. Gli attuali approcci convenzionali richiederebbero due piattaforme LC-MS dedicate, una per la proteina corona e una per il metabolita corona. Pertanto, questo approccio può raccogliere il doppio dei dati utilizzando una singola piattaforma analitica.
Ci sono alcuni avvertimenti a questo approccio in particolare con il metabolita corona in quanto questo protocollo propone una misurazione indiretta della corona. Come tale, il problema può sorgere quando i livelli di metaboliti sono presenti ad alte concentrazioni rispetto alle NN e il successivo calo della concentrazione di metaboliti nella matrice è piccolo. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che venga sviluppato un approccio "taglia unica" per isolare il metabolita corona a causa del fatto che ogni NM ha sostanze chimiche di superficie uniche. Andando avanti è più probabile che vengano sviluppati e convalidati approcci specifici per la NM per isolare il metabolita corona; questo sarà applicabile solo a quello specifico NM. Nonostante ciò, il CESI-MS sarà comunque una piattaforma altamente adatta per la caratterizzazione dei metaboliti polari carichi indipendentemente da come sono isolati. Degno di nota è anche il fatto che se un pellet non si forma durante le fasi di centrifugazione progettate per pellettare le NM, può essere necessaria una forza centrifuga più elevata; questo è più probabile che si verifichi con NN meno densi. È anche fondamentale che tutte le fasi di filtraggio siano rispettate all'interno del protocollo a causa dello stretto foro dei capillari che possono facilmente bloccarsi se il particolato non è stato adeguatamente eliminato dal campione.
Mentre la proteina corona è stata un'intensa area di ricerca per un certo numero di anni, la capacità di combinarlo con il metabolita corona è un nuovo campo di interesse per gli scienziati che studiano l'interfaccia bio-nano6,14. Ad oggi, la maggior parte di questi studi si è concentrata sulla frazione lipidica non polare del metabolita corona9,28. Questo metodo attuale consente la caratterizzazione dei metaboliti altamente polari e carichi nella corona che include importanti metaboliti coinvolti nel metabolismo energetico, nella glicolisi e nella sintesi del DNA. Di conseguenza, se combinato con il flusso di lavoro proteomico, è possibile una caratterizzazione più olistica della corona biomolecolare. Ciò consente un'analisi più approfondita delle interazioni bio-nano in futuro. Questo metodo consente una migliore conoscenza meccanicistica dell'endocitosi mediata dai recettori attraverso le interazioni di proteine e metaboliti con i recettori di membrana. Inoltre, possono essere esplorate le interazioni inter e intra corona tra proteine e piccole molecole; ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le proteine nella corona svolgono un ruolo chiave nel reclutamento dei metaboliti15. Vale la pena notare che i risultati rappresentativi nella Figura 3 e nella Figura 4 sono la quantificazione assoluta dei metaboliti, tuttavia, un approccio non targeting che utilizza l'analisi dei dati multivariati per confrontare tutte le caratteristiche CE-MS nei controlli rispetto al plasma esposto chiarirebbe anche il legame con il metabolita. Pertanto, c'è uno spazio significativo per indagare come e quali metaboliti e proteine influenzano il loro rispettivo reclutamento nelle corone NM. Questi studi aggiuntivi possono aiutare a progettare corone per ottimizzare la consegna di nanofarmaci o scoprire ulteriori ostacoli al loro sviluppo come la soppressione dell'azione farmaceutica a causa del blocco biomolecolare della corona o delle funzionalità di targeting del mascheramento.
CESI-MS con le sue portate su scala nanometrica di circa 20 nL/ min e l'uso minimo di solventi organici offre un miglioramento delle credenziali verdi ed economiche rispetto agli standard LC-MS e nanoLC-MS in termini di uso di solventi, le principali sfide per gli studi di metabolomica e proteomica, rispettivamente. CESI-MS offre risultati altamente riproducibili sia per il tempo di migrazione che per l'area di picco che si confrontano favorevolmente con i metodi basati su LC-MS11,15. Inoltre, rispetto ai nanoLC-MS, il carry-over non è un problema nel CESI-MS. Pertanto, non è necessaria un'ampia pulizia del sistema tra le analisi dei campioni, il che migliora notevolmente la produttività del campione11.
In sintesi, il flusso di lavoro proposto è il primo a dettagliare un approccio per caratterizzare sia le componenti proteiche che metabolite della corona biomolecolare completa delle RM. Ciò sblocca un nuovo aspetto delle interazioni bio-nano, il metabolita corona, consentendo così la raccolta di due volte più dati dallo stesso campione, consentendo una comprensione più completa delle interazioni all'interfaccia bio-nano.

Le interazioni bio-nano, all'interfaccia tra superfici di nanomateriali (NM) e matrici biologiche da cui le biomolecole assorbono al NM, sono un'intensa area di ricerca alla base della nanosicurezza e della nanomedicina1. Questo strato di biomolecole adsorbite conferisce un'identità biologica alle RM, quindi le cellule le identificano come "sé", influenzando successivamente l'assorbimento cellulare, la distribuzione e gli endpoint biologici2,3,4. La stragrande maggioranza degli studi bio-nano si è concentrata sulle proteine all'interno della corona e ha dimostrato che le proteine variano quantitativamente e qualitativamente tra LE NN di diverse composizioni5. Questa variazione dipende sia dalle proprietà del NM come dimensioni, funzionalizzazione e materiale, sia dalle proprietà della matrice biologica, compresa la composizione e il contenuto di sale5. Una crescente area di interesse nell'interfaccia bio-nano sono i metaboliti che assorbono aNN 6. Diversi studi hanno dimostrato che, come per le proteine, le proprietà NM sono un fattore chiave nel determinare la composizione dei metaboliti nella corona e che possono influenzare gli esiti biologici dell'esposizione a NM6,7,8.
Negli studi della corona biomolecolare ci sono quattro fasi distinte per la sua caratterizzazione, la formazione della corona, l'isolamento delle biomolecole all'interno della corona, la loro rilevazione tramite spettrometria di massa qualitativa o quantitativa e l'identificazione9. Ad oggi, sono state adottate una serie di tecniche per isolare la corona proteica, tra cui l'ebollizione nel tampone di funzionamento SDS-PAGE, le estrazioni con solvente e sale o la digestione diretta delle proteine in situ sulla superficie delle RM. In termini di metaboliti nella corona, l'isolamento è più complesso con vari metodi che utilizzano solventi o anche la dissoluzione dei NN proposti come soluzioni8,10,11. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che un approccio "taglia unica" si applichi all'isolamento dei metaboliti dalle MM, a causa dell'ampio spazio chimico occupato dal metaboloma e della diversità dei possibili MM. Un approccio alternativo consiste nel caratterizzare la matrice biologica prima e dopo l'esposizione a NM con la differenza nelle concentrazioni di metaboliti attribuita all'adsorbimento dei metaboliti alle NM.12
Questo approccio alternativo sarebbe applicabile a tutti i biofluidi e NM e, sebbene richieda il doppio dell'analisi, offre di conseguenza una misura molto più precisa del metabolita corona e non ha alcun rischio che i recuperi a basso metabolita dalla superficie NM vengano scambiati per basso legame del metabolita specifico.
Il secondo passo per l'analisi biomolecolare della corona è la rilevazione delle biomolecole. Tradizionalmente per le proteine nella corona, questo è stato il mandato della nano-LC-MS, il cavallo di battaglia della proteomica; sono stati applicati anche altri approcci come NMR13, 1D e 2D SDS-PAGE. In termini di metabolita corona LC-MS7,GC-MS8 e spettrometria di massa ad infusione diretta sono stati utilizzati14. Tuttavia, un nuovo approccio ha recentemente iniziato a guadagnare trazione, vale a dire elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS)11,15 ed è stato presente nei laboratori NM come tecnica autonoma per caratterizzare varie proprietà fisiche e chimiche di NM16. CE-MS è una tecnica di separazione ortogonale a nanoLC-MS e GC-MS ed è in grado di consentire la rilevazione di metaboliti altamente polari e carichi17,18. Inoltre, CE-MS è adatto per l'analisi delle proteine e delle loro modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione e la glicosilazione19,20,21,22. La fase finale, l'identificazione e l'analisi dei dati possono essere eseguite in diversi modi a seconda che venga utilizzato un approccio quantitativo / qualitativo o mirato / non mirato, questo, tuttavia, esula dal mandato di questo protocollo.
CESI-MS, una combinazione di CE e un'interfaccia nanoESI, è un recente progresso nella tecnologia CE che utilizza un'interfaccia senza guai. Ciò consente il collegamento diretto di CE a flusso ultra-basso (<20 nL / min) a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione senza diluizione, con conseguente sensibilità di rilevamento significativamente migliorata23,24,25. CESI-MS consente di analizzare campioni a volume limitato (< 10 μL) mantenendo un'analisi altamente sensibile26. CESI-MS si confronta anche favorevolmente con i tradizionali approcci nanoLC-MS a bassa portata utilizzati in proteomica e metabolomica in termini di riproducibilità27,28,throughput e carry over, rendendolo una prospettiva entusiasmante per la caratterizzazione completa della corona biomolecolare.
Per evidenziare il potenziale del CESI-MS per le analisi delle interazioni bio-nano, questo lavoro descrive la preparazione del campione necessaria per isolare la corona biomolecolare NM da un singolo campione di plasma umano in modo tale da massimizzare i dati sia dagli aspetti proteici che da quelli metabolitici della corona NM biomolecolare completa. Mentre riportiamo sull'uso del plasma umano, questo protocollo sarebbe ugualmente appropriato per altri biofluidi come il siero del sangue, il terreno di coltura cellulare completo, il lisato cellulare, il liquido cerebrospinale o l'urina. Le analisi di questi due componenti (proteine e metaboliti) saranno poi descritte utilizzando capillari CESI rivestiti neutri per la corona proteica e capillari di silice fusi nudi per metaboliti sia cationici che anionici.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

L'adsorbimento delle biomolecole dalle matrici biologiche circostanti alla superficie dei nanomateriali (NN) per formare la corona è stato di interesse negli ultimi dieci anni. L'interesse per l'interfaccia bio-nano nasce dal fatto che la corona biomolecolare conferisce un'identità biologica alle RM e quindi induce il corpo a identificarle come "sé". Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le proteine nella corona sono in grado di interagire con i recettori di membrana per influenzare l'assorbimento cellulare e hanno stabilito che la corona è responsabile del traffico cellulare di NG e della loro eventuale tossicità. Ad oggi, la maggior parte della ricerca si è concentrata sulla proteina corona e ha trascurato i possibili impatti dei metaboliti inclusi nella corona o gli effetti sinergici tra i componenti della corona biomolecolare completa. Come tale, questo lavoro dimostra metodologie per caratterizzare sia i componenti proteici che quelli metaboliti della corona biomolecolare utilizzando approcci di proteomica e metabolomica bottom-up in parallelo. Ciò include un digest su particella della corona proteica con un tensioattivo utilizzato per aumentare il recupero proteico e una caratterizzazione passiva del metabolita corona analizzando le matrici di metaboliti prima e dopo le esposizioni NM. Questo lavoro introduce l'elettroforesi capillare – spettrometria di massa (CESI-MS) come nuova tecnica per la caratterizzazione della corona NM. I protocolli qui delineati dimostrano come CESI-MS possa essere utilizzato per la caratterizzazione affidabile sia della proteina che del metabolita corona acquisiti dalle RM. Il passaggio a CESI-MS riduce notevolmente il volume di campione richiesto (rispetto ai tradizionali approcci di cromatografia liquida – spettrometria di massa (LC-MS)) con iniezioni multiple possibili da un minimo di 5 μL di campione, rendendolo ideale per campioni a volume limitato. Inoltre, le conseguenze ambientali dell'analisi sono ridotte rispetto a LC-MS a causa delle basse portate (<20 nL/min) in CESI-MS e dell'uso di elettroliti acquosi che eliminano la necessità di solventi organici.

Il metodo descritto è il primo a caratterizzare sia le proteine che i metaboliti nella corona biomolecolare NM utilizzando lo stesso campione di plasma umano. Questo metodo è in grado di rilevare >200 proteine e metaboliti >150, consentendo così di determinare la panoramica più completa della corona biomolecolare completa, consentendo una migliore comprensione dell'attaccamento cellulare, dell'assorbimento e degli impatti delle RM.
L'uso di CESI-MS sia per la separazione e la rilevazione della proteomica (Figura 1) che per la metabolomica (Figura 2) mostra buone finestre di separazione su entrambi i capillari per ciascun approccio.
Questo metodo è in grado di distinguere tra le proteine nella corona in un'ampia gamma di composizioni di NN, dimostrando così l'applicabilità dei metodi alle NN in un'ampia gamma di caratteristiche fisiche e chimiche (Tabella 1).
Le impronte digitali uniche del metabolita corona possono anche essere distinte usando il ramo metabolomico di questa metodologia (Figura 3). Sebbene questo approccio utilizzi un approccio passivo per caratterizzare il metabolita NM corona, è ancora in grado di scoprire interessanti approfondimenti sul ruolo dei metaboliti nella corona biomolecolare come l'adsorbimento differenziale degli isomeri (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Elettroferogramma esemplare di una separazione corona della proteina SiO2 utilizzando CESI-MS a seguito di un digest su particella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di elettroferogrammi ionici estratti ottenuti da composti endogeni nel plasma da CE-MS. I composti numerato sono i seguenti: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Istidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutammina; 16. Acido glutammico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina solfone (standard interno). Pubblicato sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto e riprodotto da Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Analisi della corona proteica in una serie di 6 NMs. Mappa termica delle classi proteiche identificate su silice (SiO2), titania (TiO2), titania ricoperta di PVP (TiO2-PVP), titania ricoperta di dispex (TiO2-Dispex), polistirene e polistirene CARBOSSILATO NMs. Le percentuali si riferiscono all'abbondanza delle proteine rispetto al contenuto proteico totale in base all'abbondanza dei primi 3 peptidi per ciascuna proteina. Date le differenze osservate nelle abbondanze relative di proteine nelle diverse corone NM, è chiaro che questo protocollo proposto è sufficientemente sensibile per distinguere tra la corona proteica di diversi NM. Figura riprodotta da un'analisi CESI-MS della corona proteica, pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Analisi mirata dei metaboliti cationici nella corona NM. Adsorbimento dei cationi a SiO2 e TiO2 NMs. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale dei metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con i NN a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita nella soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per i NN di polistirene. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Analisi mirata dei metaboliti anionici nella corona NM con particolare attenzione all'adsorbimento degli isomeri. L'adsorbimento degli anioni in una gamma di TITANIA NMs mostra chiare differenze tra vari isomeri come i fosfati di zucchero. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale di metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con il NM a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita in soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per il SiO2 e il polistirene NMs. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Common CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analita</td>
			<td>Area media di picco RSD</td>
			<td>Tempo medio di migrazione RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptidi intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi infragiogiosi (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi inter-giorno (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Riproducibilità delle repliche tecniche CESI-MS per peptidi e metaboliti cationici. RSD: deviazione standard relativa, come misura di riproducibilità. La riproducibilità del CESI-MS in termini di aree di picco e tempi di migrazione è molto buona, con tutti gli analiti che hanno un RSD medio <15% e i tempi di migrazione <2,2%. Questi risultati dimostrano l'elevato grado di confidenza che può essere attribuito ai dati raccolti utilizzando questa tecnica e confermano che le variazioni rilevate sono dovute a differenze reali nella composizione del campione (arricchimento su NN) piuttosto che alla variazione analitica. La Tabella 2 è generata dai risultati presentati in precedenza11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Qui presentiamo un protocollo per caratterizzare la corona biomolecolare completa, le proteine e i metaboliti, acquisiti dai nanomateriali dai biofluidi utilizzando un approccio di elettroforesi capillare – spettrometria di massa.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Views.  University of Birmingham. Qui presentiamo un protocollo per caratterizzare la corona biomolecolare completa, le proteine e i metaboliti, acquisiti dai nanomateriali dai biofluidi utilizzando un approccio di elettroforesi capillare – spettrometria di massa.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Ricerca

Biochimica

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Ricerca sul cancro

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Chimica

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biologia

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l&#39;analisi delle proteine ​​complesse

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

Riepilogo

Esplora Altri Video

PLAYLIST