Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari che coinvolgono la patogenesi dell'uveite posteriore umana immuno-mediata. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso lo studio traslazionale dell'uveite umana nel monitoraggio dell'efficacia di nuovi farmaci e per fornire informazioni meccanicistiche sulla progressione della malattia chimica. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo modello è l'affidabilità dell'induzione della malattia e l'uso di tecniche endoscopiche non invasive che ci consentono di monitorare la progressione della malattia.
Qui descriviamo come indurre la malattia e valutare la patologia utilizzando diverse letture Per preparare IRBP 1-20 completo adiuvante di Freund o CFA, risospendere una quantità calcolata del peptide in un volume minimo di DMSO al 100%. Quando la polvere si è completamente sciolta, aggiungere piccoli volumi di PBS al tubo fino a raggiungere il volume finale calcolato di PBS in base al numero di topi da iniettare usando una leggera agitazione per miscelare la soluzione. Dopo aver preparato l'adiuvante completo di Freund, pipettare delicatamente e frequentemente la soluzione per formare un viscus e un'emulsione uniformemente distribuita, aggiungendo la soluzione peptidica DMSO PBS goccia a goccia in un rapporto uno a uno alla sospensione.
Per aerare le soluzioni, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri impostata su 700 microlitri per pipettare ripetutamente la soluzione fino ad ottenere un'emulsione densa e cremosa. Prima di iniettare la sospensione peptidica, posizionare ciascun topo da iniettare in una gabbia separata e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago da 23 gauge per somministrare per via intraperitoneale 1,5 microgrammi di tossina Bordetella pertussis in 100 microlitri di terreno RPMI 1640 integrato con siero di topo all'1% a ciascun animale. Quando la soluzione di tossina della pertosse è stata iniettata, il topo deve essere tenuto in una posizione simile alla collottola e la pelle pizzicata per formare una struttura simile a una tenda sulla parte posteriore del collo.
Infilare l'ago nello spazio tra il dito e il pollice e iniettare 200 microlitri di emulsione IRBP sulla pelle tendata, mantenendo la pressione dopo l'iniezione e ruotando la testina dell'ago per chiudere la pelle prima della retrazione. Per valutare la malattia clinica, il giorno 21 dopo l'iniezione, confermare una mancanza di risposta al riflesso del petalo nel topo iniettato peptide anestetizzato e trattenere l'animale in una collottola. Applicare localmente 1% tropicamide e 2% fenilefrina sulla cornea di ciascun occhio immediatamente dopo l'iniezione.
Quando le pupille sono completamente dilatate, posizionare il mouse su un palcoscenico per microscopio appositamente costruito. Posizionare il microscopio per un accesso completo alla retina. Regolare l'oculare durante tutto il processo di imaging, se necessario, per vedere il disco ottico e la retina e acquisire immagini dell'intera area retinica, regolando e coprendo tutti gli angoli della periferia.
Per misurare la perdita del vaso, somministrare 100 microlitri di fluoresceina al 2% per via sottocutanea nella parte posteriore del collo e riposizionare il topo in modo tale che la retina sia al centro dell'immagine dal vivo. Impostare il fundoscopio su un filtro di eccitazione a luce blu a 465-490 nanometri prima di acquisire un'immagine di ciascuno a 1,5 e sette minuti dopo l'iniezione fluorescente. Quando tutte le immagini sono state acquisite, somministrare per via intraperitoneale un'anti-sedazione iniettabile per il recupero e posizionare il topo in una gabbia su un tappetino preriscaldato con accesso a una dieta umida imbevuta di monitoraggio fino a quando il topo non riprende conoscenza.
Per il punteggio della malattia clinica delle immagini, basare la valutazione clinica sulla gravità dell'infiammazione del disco ottico, sull'ammanettamento dei vasi retinici, sull'infiltrato del tessuto retinico e sul danno strutturale. Assegna un punteggio a ciascuno di questi parametri su una scala da uno a cinque. Il totale collettivo è rappresentativo della malattia clinica per l'intero occhio con un punteggio massimo di 20 ottenibile per occhio.
Dopo l'imaging del fondo oculare per l'endpoint clinico finale dello studio, eutanasia del topo. Per l'analisi istologica, separare le palpebre per l'accesso a tutto l'occhio, quindi posizionare una pinza curva dietro il globo per afferrare il tessuto connettivo orbitale e il nervo ottico ed enucleare l'occhio. Posizionare l'occhio enucleato in uno o cinque millilitri di glutaraldeide al 4% per un minimo di 15 minuti prima di trasferire l'organo a uno o cinque millilitri di formaldeide al 10% per almeno 24 ore.
Dopo la colorazione istologica del tessuto, secondo protocolli standard, assegnati punteggi su una scala da zero a tre in base al livello di infiltrazione delle cellule immunitarie e al grado di danno retinico. I cambiamenti fundoscopici sono classificati durante la progressione della malattia come cambiamenti infiammatori che includono il tessuto retinico e l'infiammazione del disco vascolare e ottico e danni strutturali della retina oltre a cambiamenti istologici basati su cellule immunitarie infiltranti e menomazioni strutturali. Questi cambiamenti clinici e istopatologici possono essere classificati e valutati per valutare la progressione della malattia e per valutare l'efficacia dell'intervento terapeutico.
La perdita vascolare è anche una caratteristica patologica del modello e dell'uveite umana. Come illustrato in questa analisi, la fluoresceina può essere utilizzata per visualizzare la perdita vascolare come un'altra lettura di questo modello. È essenziale che i ricercatori assicurino che l'emulsione sia preparata correttamente senza segni di separazione tra le soluzioni.
Dovrebbero essere mescolati accuratamente e il prodotto finale dovrebbe avere una consistenza liscia. Questa procedura può essere combinata con altri metodi di somministrazione di farmaci e con la citometria per la fenotipizzazione di popolazioni di cellule immunitarie retiniche infiltranti.
