Sostenuto in parte da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health (R01 NS37253 e N01 NS055167) e la National Multiple Sclerosis Society (RG 3288-A6).

1. Preparazione CFA-emulsionato Antigen <ol><li> Sciogliere cavia MBP (preparato secondo il metodo di Swanborg1 e conservate in forma liofilizzata a 4 ° C) in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 2 mg / mL. Se peptidi sintetizzati MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 vengono utilizzati, preparare un 2 mg / mL di soluzione. Redigere una quantità appropriata di soluzione antigene (0.1 mL per mouse per essere immunizzati) in una siringa di vetro con luer-lok. </li><li> Disegnare un volume di adiuvante completo di Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) pari alla soluzione di antigene in un&#39;altra siringa di vetro munito Luer-Lok. </li><li> Collegare i due siringhe di vetro con una valvola a tre vie. Miscelare la soluzione MBP con il CFA spingendo gli stantuffi e indietro. Mantenere il movimento fino a quando si forma un&#39;emulsione. </li><li> Per testare se si forma un&#39;emulsione, spingere tutta la miscela in una siringa. Staccare la siringa vuota, tirare tegli stantuffo un po &#39;e scaricare una goccia di residuo emulsione in un bicchiere di acqua a temperatura ambiente. Se la caduta di emulsione rimane intatto sulla superficie dell&#39;acqua, si forma un&#39;emulsione. Se la caduta di emulsione disperde, ricollegare le siringhe e continuare il movimento di miscelazione. </li><li> Utilizzare una siringa di plastica 1 mL per il processo di immunizzazione per garantire la fornitura di una dose precisa di antigene. Per trasferire l&#39;emulsione antigene alla siringa plastica, estrarre ed inserire lo stantuffo della siringa vuota plastica nell&#39;apertura della valvola a tre vie in cui è stato scollegato la siringa di vetro precedente come in 1,4. </li><li> Riempire la siringa di plastica al bordo premendo lo stantuffo della siringa di vetro. Inserire lo stantuffo della siringa di plastica e spingere indietro emulsione in eccesso fino a raggiungere il 1,2 mL segno sulla siringa di plastica. Questa manovra assicura che nessuna bolla d&#39;aria intrappolata all&#39;interno della siringa plastica. </li><li> Rimuovere la siringa plastica dalla valvola a tre vie. Atta# ch un ago calibro 26 alla siringa plastica. Premere lo stantuffo al contrassegno 1 mL modo che l&#39;emulsione ora riempie il volume di vuoto dell&#39;ago. </li></ol> 2. Immunizzazione dei topi donatori Nota: topi femmina C57BL / 6 sono in genere iniettato con l&#39;emulsione di antigene in quattro siti nei fianchi, secondo le modalità originariamente progettati dal gruppo di McFarlin a 3 presso i National Institutes of Health. Per un ricercatore esperto, una persona può svolgere il compito insieme. Per i principianti, l&#39;aiuto può essere sollecitato in modo che una persona tiene il mouse e l&#39;altra persona fa l&#39;iniezione. In alternativa, il mouse può essere anestetizzati per l&#39;iniezione. <ol><li> Tenete il mouse saldamente la pelle del collo e trattenere la coda tra le dita ° 4 ° e 5 tali che il torace e l&#39;addome sono facilmente accessibili. </li><li> Posizionare l&#39;ago della siringa 1 ml di plastica in un sito nel torace leggermente sopra l&#39;ascella destra (del mouso) e iniettare 0,05 ml di emulsione antigene sottocutanea. Un po &#39;di rigonfiamento biancastro CFA può essere visto attraverso la pelle pallida. Ripetere la stessa per il sito nel torace leggermente sopra l&#39;ascella sinistra. </li><li> Rilasciare la coda e afferrare il piede destro (del mouse), girarla e tenerla tra il 4 ° e 5 ° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco destro e iniettare 0,05 ml dell&#39;emulsione antigene. </li><li> Rilasciare il piede destro, ruotare il mouse dall&#39;altra parte e tenere premuto il piede sinistro (del mouse) tra il 4 ° e 5 ° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco sinistro e iniettare 0,05 ml dell&#39;emulsione antigene. </li><li> Cambiare un ago fresco dopo l&#39;iniezione di 10 topi, o se l&#39;ago diventa offuscato. </li></ol> 3. Isolamento di cellule dei linfonodi per il Tissue Culture 7 a 10 giorni dopo l&#39;immunizzazione <ol><li> Sette a 10 giorni dopo la vaccinazione, sacrificare i topie rimuovere i linfonodi drenanti. Il metodo preferito di eutanasia è di CO 2 per inalazione. Dopo il sacrificio, giaceva il mouse sul dorso su una tavola di dissezione con le gambe aperte e fissato alla scheda con perni. I topi sono bagnate con uno spruzzo di etanolo 70%. </li><li> Tagli una fenditura nella pelle longitudinalmente al centro dall&#39;estremità inferiore dell&#39;addome fino al mento con forbici sterili e pinze. </li><li> Tagliare la pelle dell&#39;addome dalla zona inguinale del basso per ogni gamba. Peel indietro e definire con precisione la pelle, esponendo i linfonodi inguinali. </li><li> Tagliare la pelle lungo il arti anteriori (sinistra e destra) in modo che la pelle può essere sfogliato indietro e immobilizzato per esporre i linfonodi ascellari vicino alle ascelle. </li><li> Con due paia di pinze lavorano insieme, tirare via il tessuto connettivo di copertura e intorno ai linfonodi inguinali. Quando i tessuti connettivi vengono cancellati, mettete un paio di pinze sotto il linfonodo e tirare fuori dal corpo. Posizionare illinfonodi in un piatto 35 millimetri Petri riempita con PBS sterile. </li><li> Sganciare i tessuti connettivi che coprono i due linfonodi ascellari con due paia di pinze. Isolare i linfonodi e metterli nella scatola di Petri. Fare molta attenzione a non rompere i vasi sanguigni che attraversano l&#39;area come sanguinamento fa identificare i linfonodi molto difficile. </li><li> Dopo che tutti i linfonodi sono raccolti, spostare la piastra di Petri di una cappa di biosicurezza. Break e provocare gli linfonodi distanza con le due coppie di pinze, macinazione uno contro l&#39;altro. In alternativa, i linfonodi può essere rotto mediante l&#39;estremità piatta dello stantuffo di una siringa di plastica 3 mL premendo contro i linfonodi sul fondo del piatto Petri. </li><li> Passare il nodo preso in giro sospensione linfa cellulare attraverso una rete di nylon per rimuovere le membrane e detriti. </li><li> Portare il nodo della sospensione delle cellule linfatiche a 50 ml con PBS sterile. Centrifugare a 1000 rpm per 10 minuti. Risospendere il pellet in terreno di coltura. Sei una valida cell contare e regolare la concentrazione di 4 x 10 6 cellule / mL. UseRPMI 1640 integrato con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, 1 MEM mM piruvato di sodio, 0,1 mM MEM amminoacidi non essenziali, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 10 mM di tampone Hepes e 5 x 10 -5 M 2-ME. Pre-riscaldare la cultura prima di risospendere le cellule. </li><li> Coltivare le cellule in piastre da 24 pozzetti di coltura con 2 mL di volume per pozzetto (concentrazione finale della cella 8 x 10 6 cellule / pozzetto). Aggiungere antigene a ciascun pozzetto ad una concentrazione finale di 100 pg / mL. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. Incubare le cellule per 5 giorni. </li></ol> 4. Raccolta coltivate cellule dei linfonodi 5 giorni dopo l&#39;inizio delle Culture <ol><li> Mescolare le cellule in ciascun pozzetto pipettando su e giù con una pipetta Pasteur di vetro o una pipetta piccolo volume. Raccogliere le cellule ad una provetta da centrifuga da 50 mL. </li><li> Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 10 minuti. Resuspend il pellet di cellule in un piccolo volume di PBS. </li><li> Contare le cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali di 2,5 x 10 8 cellule / ml con PBS sterile. Disegnare le cellule in una siringa con un ago # 26 gauge. </li><li> Posizionare una lampada di calore sopra la gabbia dei topi riceventi per dilatare la vena della coda. </li><li> Utilizzando un supporto per mouse, estendere la coda del topo attraverso la fessura nel supporto. Tirare per estendere la coda. Individuare la vena. </li><li> Iniettare 0,2 ml / topo della sospensione cellulare, pari a 5 x 10 7 cellule. </li></ol> 5. Stimolo antigenico di topi riceventi 20 giorni cellulare vaglia postale e lo sviluppo dei sintomi della malattia <ol><li> Sfida topi riceventi non mostra segni di malattia con l&#39;antigene. Le procedure sono le stesse in sezione 2 &quot;immunizzazione di topi donatori&quot;. </li><li> Osservare lo sviluppo di malattia paralitica da 7 a 10 giorni dopo uno stimolo antigenico. <ol><li> Malattia inizia con la debolezza nella coda. La malattia è classificato come 1quando la coda diventa flaccida. La malattia è classificata come 2 quando il mouse è paralizzato in un arto posteriore. La malattia è classificato 3 quando entrambi gli arti posteriori sono paralizzate e il mouse trascina entrambi gli arti posteriori durante la scansione in avanti. La malattia è classificato 4 quando il mouse perde uso di entrambe le arti anteriori, lasciando il mouse completamente immobile. La malattia è classificato 5 quando il mouse è moribonda e il corpo si raggomitola. La morte è valutata come la malattia di grado 6 4. </li></ol></li><li> MBP-specifica EAE indotta in topi C57BL / 6 in seguito questo protocollo è monofasica. I topi possono recuperare dalla malattia, ma non subiscono ricadute spontanee. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi I topi che hanno ricevuto innescato ed espanse in vitro cellule linfatiche donatore nodo non ha sviluppato sintomi della malattia EAE, riflettendo la loro resistenza a induzione della malattia. Tuttavia, malattia grave sviluppato dopo stimolo antigenico (Tabella I), dimostrando la capacità della stimolazione antigenicainvertire il meccanismo di resistenza. Due le caratteristiche particolari della sfida antigenica nota sono le dosi di antigene e la cinetica della sfida di indurre la malattia. Dosi molto basse di antigene è necessario, come mostrato nella Tabella III. Sorprendentemente, i topi che avevano ricevuto cellule del donatore di un anno prima potrebbe ancora sviluppare una grave malattia quando provocati con l&#39;antigene (Tabella IV). Queste due osservazioni suggeriscono il coinvolgimento di &quot;lunga durata&quot; cellule T nel mantenimento della resistenza EAE. Questo protocollo è applicabile a molti ceppi di topi EAE resistenti 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del disegno sperimentale per l&#39;induzione di EAE in fama ceppi di topi resistenti. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Clinical EAE dopo il trasferimento adottivo </td><td colspan="3"><strong&gt; Clinical EAE dopo stimolazione antigenica </td></tr><tr><td> Sforzo </td><td> Antigene </td><td> incidenza </td><td> Av. malattia di grado (Range) </td><td> Av. giorno di comparsa (Range) </td><td> Incidenza </td><td> Av. malattia di grado (Range) </td><td> Av. giorno di comparsa (Range) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21/21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7/7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Balb / c </td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> Tabella I. Induzione di MBP-mediata EAE in topi C57BL / 6. Trasferimento adottivo di EAE e innescato espanse in vitro cellule donatrici non ha indotto in topi C57BL / 6. Stimolo antigenico vaglia postale cella reso i topi suscettibili di induzione della malattia. Av., Media. ND, non ha fatto. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clinica dopo uno stimolo antigenico </td></tr><tr><td> Priming Antigen </td><td> Sfida antigene </td><td> Incidenza </td><td> Av. malattia di grado (Range)</td><td> Av. giorno di comparsa (Range) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> CFA da sola </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> MBP-CFA </td><td> 3/3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> Tabella II. Specificità di stimolazione antigenica. Topi riceventi sono stati stimolati con l&#39;antigene adescamento così come altri antigeni irrilevanti. Solo l&#39;antigene adescamento indotta malattia grave. OVA: ovalbumina pollo. Av., Media. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clinica dopo uno stimolo antigenico </td></tr><tr><td> Sfida dosi di antigene (mg / mouse) </td><td> Incidenza </td><td> Av. malattia di grado (Range) </td><td> Av. giorno di comparsa (Range) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4/4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4/4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4/4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2/4 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella III. Sfida dosi di antigene necessaria per l&#39;induzione della malattia. Varie concentrazioni di MBP utilizzati per sfidare topi riceventi sono stati testati. Av., Media. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clinica dopo uno stimolo antigenico </td></tr><tr><td> Sfida antigene </td><td> Giorno della Sfida </td><td> Incidenza </td><td> Av. Malattia di grado (Range) </td><td> Av. Giornata di esordio (Range) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 5 </td><td> 3/4 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 10 </td&gt; <td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 15 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 35 </td><td> 4/4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 60 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 343 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 445 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> Tabella IV. Cinetica di uno stimolo antigenico. Topi riceventi sono stati stimolati a livello post vari punto di tempo adottareive cell trasferimento. Av., Media.

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	<li>Swanborg, R. H., Sabato, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis.">Experimental allergic encephalomyelitis.</a> Methods in Enzymology. 162, 413-421 (1988).</li><li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice:+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage.">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li><li>McCarron, R., McFarlin, D. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge+induces+consistent+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+and+other+reputed+resistant+strains.">A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains.</a> J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).</li><li>Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin-specific+T+cells+also+recognize+neuronal+autoantigen+in+a+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 15, 626-632 (2009).</li><li>Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+plays+an+important+role+in+the+homeostatic+regulation+of+the+autoreactive+reperteroire+in+na&#239;ve+mice.">IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in na&#239;ve mice.</a> J. Immunol. 173, 828-834 (2004).</li><li>Anderton, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+and+T-effector+cells+in+autoimmune+CNS+inflammation:+a+delicate+balance+easily+disturbed.">Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed.</a> Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).</li><li>Arnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+-+susceptibility+and+suppression.">Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression.</a> Immunol. 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Studi di EAE nei topi utilizzano spesso le neuroantigens e proteina basica della mielina (MBP), proteine ​​proteolipidica (PLP) o di proteine ​​della mielina degli oligodendrociti (MOG). Studi precedenti in gran parte utilizzato MBP. PLP stimola risposte forti e coerenti dai topi SJL. Più di recente, MOG è la neuroantigen comunemente usato B6, perché i topi sono suscettibili di induzione della malattia con questo antigene. Molti ceppi mirati geni di topo sono su sfondo genetico B6. È interessante notare, B6 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cavia midollo spinale </td><td> Rockland Immuno-chimici, Inc. Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> congelati </td></tr><tr><td> Adiuvante di Freund completo H37Ra </td><td> Difco Laboratories Detroit, MI </td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit intercambiabili in grado di siringa </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / us</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> MediatechInc. Manassas, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Mice </td><td> Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine </td><td> B6 topi: 0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è una malattia infiammatoria del sistema nervoso centrale (CNS) ed è stato usato come modello animale per lo studio della malattia demielinizzante umano, sclerosi multipla (MS). EAE è caratterizzata da patologica infiltrazione di cellule mononucleari nel sistema nervoso centrale e da manifestazione clinica di malattia paralitica. Simile al MS, EAE è sotto controllo genetico in alcuni ceppi di topi che sono suscettibili di induzione della malattia, mentre altri sono resistenti. In genere, C57BL / 6 (H-2 b) i topi immunizzati con proteina basica della mielina (MBP) non riescono a sviluppare segni di paralisi. Questa mancanza di risposta non è certamente dovuti a difetti di lavorazione dell&#39;antigene o presentazione dell&#39;antigene di MBP, come un protocollo sperimentale descritto qui era stato usato per indurre EAE grave in topi C57BL / 6, nonché altri ceppi resistenti reputato topo. Inoltre, cloni di cellule T encefalitogeniche da C57BL / 6 e topi Balb / c reattivi per MBP stata successocompletamente isolato e propagato. Il protocollo sperimentale comporta l&#39;uso di un sistema cellulare in cui il trasferimento adottivo MBP-primer (200 pg / topo) C57BL / 6 donatori cellule dei linfonodi sono isolati e coltivati ​​per cinque giorni con l&#39;antigene per espandere il pool di MBP-cellule T specifiche. Al termine del periodo di coltura, 50 milioni di cellule vitali sono trasferite in naive riceventi singenici attraverso la vena della coda. Destinatari topi così trattati normalmente non si sviluppano EAE, riaffermando così il loro status resistenti, e possono rimanere normale a tempo indeterminato. Dieci giorni dopo il trasferimento delle cellule, topi riceventi sono sfidati con adiuvante di Freund completo (CFA)-MBP emulsionato in quattro siti nei fianchi. EAE grave inizia a svilupparsi in questi topi dieci a quattordici giorni dopo la sfida. I risultati hanno mostrato che l&#39;induzione della malattia era antigenica specifica come una sfida con gli antigeni irrilevanti non ha indotto sintomi clinici della malattia. Significativamente, una titolazione della dose di antigene utilizzato persfidare i topi riceventi hanno dimostrato che potrebbe essere il più basso 5 mg / mouse. Inoltre, uno studio cinetico della temporizzazione di stimolazione antigenica mostrato che sfida di indurre la malattia era efficace come già 5 giorni dopo stimolazione antigenica e fintantoché oltre 445 giorni dopo la stimolazione antigenica. Questi dati puntano fortemente verso il coinvolgimento di una &quot;lunga durata&quot; popolazione di cellule T nel mantenimento assenza di reazione. Il coinvolgimento delle cellule T regolatorie (Tregs) in questo sistema non è definito.

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Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

20.2K Views.  St. John-Providence Health System. Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

Uveite autoimmune sperimentale: un modello murino infiammatorio intraoculare

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Potenziamento dell'immunogenicità da parte di Mycobacterium paratuberculosis nell'encefalomielite autoimmune

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) containing inactivated Mycobacterium tuberculosis. The antigenic components of the mycobacterium activate dendritic cells to stimulate T-cells to produce cytokines that promote the Th1 response via toll-like receptors. Therefore, the amount and species of mycobacteria present during the antigenic challenge are directly related to the development of EAE. This methods paper presents an alternative protocol to induce EAE in C57BL/6 mice using a modified incomplete Freund&#39;s adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strain K-10.
M. paratuberculosis, a member of the Mycobacterium avium complex, is the causative agent of Johne&#39;s disease in ruminants and has been identified as a risk factor for several human T-cell-mediated disorders, including multiple sclerosis. Overall, mice immunized with Mycobacterium paratuberculosis showed earlier onset and greater disease severity than mice immunized with CFA containing the strain of M. tuberculosis H37Ra at the same doses of 4 mg/mL. The antigenic determinants of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)&#160;strain K-10 were able to induce a strong Th1 cellular response during the effector phase, characterized by significantly higher numbers of T-lymphocytes (CD4+ CD27+), dendritic cells (CD11c+ I-A/I-E+), and monocytes (CD11b+ CD115+) in the spleen compared to mice immunized with CFA. Furthermore, the proliferative T-cell response to the MOG peptide appeared to be highest in M. paratuberculosis-immunized mice. The use of an encephalitogen (e.g., MOG35-55) emulsified in an adjuvant containing M. paratuberculosis in the formulation may be an alternative and validated method to activate dendritic cells for priming myelin epitope-specific CD4+ T-cells during the induction phase of EAE.

Autore in primo piano: Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale  

Here, we present an alternative protocol to actively induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, using the immunogenic epitope myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspended in incomplete Freund's adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...