Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della biodisosi infiammatoria sulla colite ulcerosa e sulla malattia di Crohn. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzato per valutare i primi effetti anti e proinfammatori delle proteine di segnalazione. L'implicazione di questa tecnica estende l'indagine del gas in nuovi progressi e infiammazione.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'effetto genetico sull'infiammazione intestinale. Può anche essere applicato ad altri fattori come diete e microbioma. Generalmente, gli individui nuovi a questo semestre faranno fatica perché elaborare il tessuto cicatriziale della malattia è complicato.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione e le fasi di preparazione dei tessuti sono difficili da imparare perché la mistalia e le strutture del tessuto cellulare possono essere alterate. Per indurre il sodio solfato di dextran, o colite DDS, sostituire l'acqua potabile regolare con una soluzione 3%DSS, aggiungere libidio per sette giorni. Misurazione quotidiana del peso corporeo di ogni mouse, del consumo di soluzioni DSS e della produzione di feci.
Alla fine del trattamento di sette giorni, posizionare il mouse in posizione supina e utilizzare piccole forbici per fare un'incisione della linea mediana lunga tre centimetri nell'addome. Raccogliere la milza e misurarne le dimensioni. Quindi utilizzare le forcep per sollevare i due punti per consentirgli di separarlo dal mesenterio circostante.
Ed estrarre l'intero colon fino a quando il cieco e il retto sono visibili. Traslittare il tessuto al margine colonsecale. E nel profondo del bacino per liberare rispettivamente il colon prossimale e distale.
Misurare e registrare la lunghezza dei due punti isolati. E utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago di gavage per lavare il colon con 10 millilitri di PBS ghiacciato per rimuovere le feci e il sangue fino a quando l'illuato non si sgombra. Per l'identificazione istologica, dividere i campioni di tessuto in sezioni prossimali, medie e distali di pari dimensioni.
E fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius. Per la colorazione ematossilina ed eosina del tessuto colon isolato, la mattina successiva, immergere i pezzi di tessuto nel 30% di saccarosio e PBS durante la notte in singoli tubi da 15 millilitri per la protezione criogenica dei campioni. Il giorno dopo, incorporare i tessuti in una temperatura di taglio ottimale o composto OCT.
E raffreddare i tessuti in meno 20 gradi Celsius fino a quando lo OCT non si indurisce. Posizionare i blocchi dello Strumento di personalizzazione di Office nel criostato e impostare il quadrante dello spessore su 12 micrometri. Quindi affettare e raccogliere sezioni congelate spesse 12 micrometri su vetrini al microscopio.
Quando tutti i tessuti sono stati sescati, riscaldare gli scivoli a 65 gradi Celsius su una piastra calda per 20 minuti. E lavare brevemente le sezioni riscaldate in acqua distillata prima di macchiare con soluzione di colorazione dell'ematossilina per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di ematossilina in eccesso e correre in acqua del rubinetto per cinque minuti.
E differenziare le sezioni con lo 0,5% di acido cloridrico in etanolo per 30 secondi, seguite da un risciacquo di un minuto sotto l'acqua corrente del rubinetto. Quindi, lavare i campioni per un minuto in PBS. Seguito da altri cinque minuti di lavaggio sotto l'acqua corrente del rubinetto.
Alla fine del lavaggio, immergere i tessuti in una serie crescente di etanolo per 10 secondi per immersione. Seguito da controsottenimenti in eosin per due minuti. Per la disidratazione dei campioni, immergere le diapositive nel 95% di etanolo e due cambi di etanolo al 100% per cinque minuti per immersione.
Seguito da una cancellazione con due, cinque minuti di modifiche in xilene. Quindi segnare il danno tissutale ai colon prossimali, medi e distale di ogni gruppo sperimentale. Per l'analisi immunoistochimica, dopo aver riscaldato le sezioni per 20 minuti sulla piastra calda, lavare gli scivoli tre volte in PBS per 10 minuti per lavaggio.
Ed eliminare la perossidasi endogena con un'incubazione di perossido di idrogeno del 3% di 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBS come dimostrato e bloccare qualsiasi legame non specifico con tampone di blocco per almeno un'ora a temperatura ambiente. Quindi, sostituire il buffer di blocco con il cocktail di anticorpi primari di interesse.
Per un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius. La mattina seguente, aspirare la soluzione di anticorpi primari in eccesso e lavare le diapositive tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare gli scivoli con l'appropriato cocktail di anticorpi secondari biotinilati.
Seguito dall'etichettatura con complesso di perossidasi di rafano streptavidina a temperatura ambiente. Per visualizzare le cellule immunoreattive, etichettare i campioni con DAB fino a quando non si sviluppa un colore marrone chiaro o scuro. E controsostenere le sezioni con ematossilina e ammoniaca diluita allo 0,3%.
Quando le diapositive si sono asciugate, utilizzare un microscopio luminoso per ottenere immagini a campo luminoso delle sezioni tissutali con un ingrandimento di 10x. E utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie marcate sia nell'epitelio che nella lamina propria. Per l'analisi dell'espressione genica nei colon trattati con DSS, estrarre l'RNA da meno 80 gradi Celsius scongelato campioni di tessuto colonico secondo protocolli standard di estrazione dell'RNA.
E mescolare un microgrammo con l'RNA totale con 2,5 microlitri di 20 millimolare oligo deossitimidina da 12 a 18 primer e un microlitro di moloney murine leucemia virus invertire transcriptasi. Dopo un'incubazione di 60 minuti a 42 gradi Celsius, mescolare un microlitro del cDNA con microlitri allo 0,5% dei primer PCR quantitativi appropriati in avanti e in retromarcia per le citochine di interesse e 2x colorante verde fluorescente. Quindi eseguire la PCR quantitativa sotto i parametri appropriati e calcolare l'espressione genica relativa secondo protocolli standard.
Rispetto ai topi di tipo selvatico, i topi knockout alfa gustducina presentano una colite più grave con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale. Dopo sette giorni di somministrazione della DSS, l'analisi istologica delle sezioni del colon rivela un danno tissutale più aggravato all'interno dei colon prossimali, medi e distale dei topi knockout, rispetto alle loro controparti di tipo selvatico. Questa eccessiva attivazione immunitaria porta all'induzione della colite con una robusta infiltrazione di varie cellule infiammatorie nel colon animale knockout come osservato dall'analisi immunoistochimica.
Inoltre, l'analisi quantitativa pcr mostra livelli più elevati di espressione gamma TNF alfa e inferon ma minore espressione di IL-5, 10 e 13, in knockout rispetto ai due punti del topo del tipo selvatico senza alcuna differenza nell'espressione beta di TGF osservata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare il dosaggio di sodio sudvatro testore e la durata della dimostrazione. Inoltrando questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ottenere la coltura per comprendere ulteriori domande come l'effetto dell'infiammazione nell'origine del tessuto intestinale.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre un modo per i ricercatori nel campo dell'infiammazione intestinale di esplorare i contributi delle mutazioni geniche alla gravità degli erosi biodisease e di altri vertebrati. Non dimenticare che lavorare con il tessuto intestinale della malattia e il suo contenuto può essere estremamente pericoloso e le ripercussioni come indossare cose appropriate, la protezione personale permanente dovrebbe sempre essere presa durante l'esecuzione di questa procedura.
