L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esaminare e quantificare la rigenerazione muscolare in un modello di zebrafish di malattia muscolare. Questo metodo fornisce una pipeline ad alto rendimento che non è solo conveniente, ma anche altamente riproducibile nel segnare il potenziale rigenerativo di un muscolo malato in un ambiente in vivo. A dimostrare la procedura con me sarà Avnika Ruparelia, ricercatrice presso l'Australian Regenerative Medicine Institute.
Per la genotipizzazione di embrioni vivi, staccare il film protettivo trasparente dalla superficie superiore di un chip di estrazione del DNA a 24 camere e utilizzare una punta filtrante da 20 microlitri con una punta tagliata per trasferire un singolo embrione anestetizzato in 13 microlitri di mezzo embrionale in ciascuna camera del chip. Quando tutti gli embrioni sono stati caricati, montare delicatamente il chip sulla piattaforma di genotipizzazione dell'embrione di zebrafish posizionando un lato in primo luogo, seguito dal resto del chip. Apporre il coperchio della piattaforma magnetica sul chip per impedire l'evaporazione del mezzo embrionale durante il protocollo di estrazione del DNA e chiudere il coperchio.
Impostare l'unità di base su 2,4 volt, 0,051 ampere e 0,12 watt e avviare il protocollo di estrazione del DNA. La piattaforma dovrebbe iniziare a vibrare, che può essere valutata toccando delicatamente il coperchio. Mentre il programma è in esecuzione, preparare una piastra a 24 pozzetti aggiungendo un millilitro di mezzo embrionale a ciascun pozzetto ed etichettare tubi a strisce a otto pozzetti da utilizzare per la raccolta di materiale di DNA da ciascun embrione.
Dopo otto minuti di estrazione, premere il pulsante di accensione / spegnimento per interrompere la vibrazione della piattaforma, rimuovere delicatamente il coperchio magnetico e sollevare il chip dalla piattaforma. Trasferire 10 microlitri di mezzo embrionale da una camera nel pozzo appropriato del tubo a strisce a otto pozzi e aggiungere immediatamente due gocce di terreno embrionale fresco alle camere. Trasferire l'embrione dalla camera a un pozzo appropriato della piastra a 24 pozzi precedentemente preparata.
Quando tutti gli embrioni sono stati trasferiti, posizionare la piastra in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. Eseguire gli opportuni test di genotipizzazione a valle sul materiale genetico raccolto nei tubi a strisce a otto pozzi per determinare il genotipo di ciascun embrione. Una volta identificato il genotipo di ciascun embrione, trasferire gli embrioni in piastre di Petri da 90 millimetri contenenti 25 millilitri di acqua media e incubare le piastre a 28 gradi Celsius fino alla lesione muscolare.
A quattro giorni dopo la fecondazione, utilizzare una pipetta per trasferire una larva anestetizzata in una nuova capsula di Petri e rimuovere con cura qualsiasi mezzo in eccesso dal piatto sotto un microscopio sezionante. Orienta il pesce in modo tale che la testa sia a sinistra, la coda sia a destra, la regione dorsale sia in alto e la regione ventrale sia verso il basso, e usa un ago calibro 30 per fare una pugnalata rapida e precisa in uno o due somiti nel muscolo epaxial sopra il poro anale e orizzontale al miosepto. Applicare una goccia di mezzo embrionale al pesce zebra ferito e trasferire con cura la larva in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di embrione fresco per pozzetto.
Quando tutte le larve sono state ferite, posizionare la piastra nell'incubatrice a 28 gradi Celsius fino a quando il pesce zebra non viene ripreso. Per quantificare la rigenerazione muscolare, aprire un'immagine post-infortunio di un giorno in un programma software di analisi delle immagini appropriato e utilizzare lo strumento poligono per disegnare una forma attorno al sito della ferita. Utilizzare il software per misurare l'area e l'intensità media di birifrangenza della regione e copiare questi valori nelle celle D3 ed E3 del modello fornito.
Disegna due regioni aggiuntive che coprono ciascuna da uno a due somiti illesi e misura l'area e le intensità di birifrangenza media di ciascuna di queste regioni. Copiare questi valori nelle celle D4 e D5 e E4 ed E5 nel modello. Quindi ripetere la misurazione per le stesse regioni nell'immagine dei tre giorni post-infortunio.
Quando la birifrangenza è stata misurata nello stesso modo in tutte le immagini, calcolare la birifrangenza normalizzata per ogni regione dividendo l'intensità media di birifrangenza di ciascuna regione per la sua area. Per ogni punto temporale, calcolare la birifrangenza media normalizzata delle due regioni non lese per fornire un punto di riferimento per il muscolo non infortunato. Per determinare l'entità della lesione muscolare al primo giorno post-infortunio, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione per la birifrangenza media normalizzata delle regioni non ferite.
Per determinare l'entità della rigenerazione muscolare, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione nell'immagine post-lesione di tre giorni per l'intensità media normalizzata delle regioni non ferite in questa fase. Infine, calcola l'indice rigenerativo dividendo il valore per l'estensione della rigenerazione muscolare al terzo giorno post-infortunio per il valore per l'entità della lesione muscolare al primo giorno post-infortunio. In questa analisi rappresentativa, una frizione di embrioni da un incrocio tra due pesci zebra eterozigoti Lama2 è stata trasferita in un chip di estrazione del DNA e successivamente genotipata.
Mentre la lesione muscolare si traduce in una riduzione dell'intensità della birifrangenza al primo giorno dopo l'infortunio, la rigenerazione riuscita del muscolo si traduce in un aumento della birifrangenza all'interno della stessa regione. È anche interessante notare che mentre le larve selvatiche mostrano un'intensità di birifrangenza uniforme a causa di un normale pattern muscolare, l'intensità di birifrangenza nel muscolo delle larve knockout lama2 è irregolare e altamente sporadica probabilmente a causa di una ridotta integrità muscolare. Come osservato, sia il tipo selvatico che le larve carenti di Lama2 mostrano un'intensità di birifrangenza significativamente aumentata nel sito della ferita a tre giorni dopo l'infortunio rispetto a un giorno dopo l'infortunio, indicando che il muscolo si è rigenerato.
La determinazione dell'indice rigenerativo rivela che le larve carenti di Lama2 mostrano un notevole aumento della rigenerazione muscolare rispetto agli animali selvatici. Mentre questo protocollo ci permetterà di identificare eventuali alterazioni nella capacità del muscolo di rigenerarsi in modelli di malattie muscolari, è necessario eseguire analisi cellulari e molecolari a valle per identificare i meccanismi responsabili dei cambiamenti osservati. Questo metodo ci ha permesso di identificare come la compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e una compromissione degli elementi di nicchia associati contribuiscano alla patogenesi della malattia muscolare, permettendoci quindi di identificare nuovi meccanismi di malattia.
