Si ringrazia Manuela Weitkunat per l'acquisizione di film S3. Siamo grati a Reinhard Fässler per il generoso sostegno. Questo lavoro è stato supportato da EMBO Young Investigator programma (F.S.), il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la società Max Planck (S.B.L., F.S.), il Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l'iniziativa di eccellenza OKTIM Università di Aix-Marseille (F.S.), informare LabEX (F.S.) e la Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. fase pupe
<ol><li>Impostare una croce con 20-40 Vergine femmine e maschi circa 20 a bottiglia di alimento (Figura 1A). In alternativa, se verranno utilizzate scorte, è possibile capovolgere ogni stock in nuove bottiglie. Per ottenere abbastanza pupe, considerare la creazione due bottiglie al genotipo.</li>
	<li>Incubare le bottiglie a 25 ° C (o 27 ° C secondo il disegno sperimentale) per cinque o sei giorni (Figura 1B). Nota: Tenere lanciando le mosche ogni due o tre giorni per evitare il sovraffollamento e per garantire un approvvigionamento continuo di pupe.</li>
	<li>Utilizzare un pennello bagnato per raccogliere membranose bianchi dalle pareti delle bottiglie e trasferirli alle diapositive di vetro (Figura 1). La messa in scena del tempo tali che le pupe raggiungono la desiderata età quando a partire dal vivo imaging sotto il microscopio. Nota: Questi membranose come pupe più vecchi in termini di loro forma, ma sono ancora bianchi come larve. L'inizio della fase di prepupa è definito come 0 h dopo la formazione del pupario (0h APF).</li>
	<li>Rimuovere macchie di cibo volo attaccando per le pupe con un pennello bagnato e orientare il lato ventrale delle pupe verso il vetrino utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 1). Scartare le pupe che sono ancora in movimento (troppo giovane) o che hanno iniziato a girare il colore marrone (troppo vecchio). Questo assicura che tutte le pupe hanno la stessa età (0 - 1 h APF).</li>
	<li>Marcare i vetrini con genotipo, data e ora della raccolta. Trasferire i vetrini in una capsula di petri e aggiungere un panno umido per evitare che le pupe secchino (Figura 1E).</li>
	<li>Memorizzare le pupe in un incubatore a 25 ° C o 27 ° C, fino a quando raggiungono l'età desiderata. Continuare con i passaggi successivi 1 h prima di formazione immagine, in modo che le pupe hanno desiderato età quando a partire dal vivo imaging (passaggio 3), ad esempio a 13 h APF per il film mostrato nella Figura 2A-D. Nota: Il più presto fattibile tempo punto di partenza è dopo testa-rovesciamento delle pupe che si verificano a 8-10 h APF a 27 ° C.</li>
</ol>2. preparare pupe per l'Imaging
<ol><li>Assicurarsi che le pupe ora incolli sul vetrino, come naturalmente si attaccano alle pareti delle bottiglie a causa di residui alimentari volare. Nessuna colla supplementare è richiesta. Se le pupe non si attacchino abbastanza bene a causa della elevata umidità, aprire la capsula di Petri per qualche minuto per farli asciugare. In alternativa, trasferirli al nastro biadesivo su un vetrino, ma di solito, questo non è necessario.</li>
	<li>
Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli di volo indiretto (Figura 1F; Passare alla sezione 2.3 per l'imaging dei muscoli addominali).<ol>
<li>Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore si allontani il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.</li>
		<li>Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce l'addome e il torace comincia.</li>
		<li>Per sezionare aperto il caso pupal, delicatamente spostare la pinza all'estremità anteriore del torace lungo l'ala, ma evitare di danneggiare il tessuto vulnerabile ala. Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente.</li>
		<li>Sollevare la sezione del caso pupal sopra il torace con le pinze e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli addominali (Figura 1)<ol>
<li>Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore rivolta verso il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.</li>
		<li>Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce il torace e l'addome inizia.</li>
		<li>Per sezionare aperto il caso pupal, muovete delicatamente la pinza verso l'estremità posteriore dell'addome. Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente.</li>
		<li>Sollevare la sezione del caso pupal sopra l'addome con il forcipe e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mount pupe (Figura 1 H)<ol>
<li>Utilizzare un pennello bagnato per trasferire fino a cinque pupe a una diapositiva in plastica con una scanalatura (Vedi costruito su misura, riutilizzabile, la discussione ed elenco dei materiali). Aggiungere uno o due vetrini coprioggetti distanziale per ciascun lato a seconda della profondità della scanalatura e lo spessore delle pupe. Mettere una piccola goccia di acqua sotto ogni vetrino coprioggetti distanziale per farlo aderire alla diapositiva e lasciare spazio tra il groove e i coprioggetti distanziale su ogni lato. Nota: Lamelle distanziatore possono anche essere fissate in modo permanente alla diapositiva con colla super, in anticipo.</li>
		<li>Orientare le pupe tale che l'apertura nel caso pupal sia rivolta verso l'alto utilizzando il pennello. Assicurare un posizionamento accurato delle pupe l'angolo corretto per buona qualità delle immagini. Ottimizzare l'angolo per ogni tessuto e punto di tempo inerente allo sviluppo. Nota: Una piccola quantità di acqua nella scanalatura rende il posizionamento delle pupe più facile. Scolare l'acqua in eccesso con il pennello in seguito per evitare l'annegamento.</li>
		<li>Tenere un vetrino coprioggetti (18 x 18 mm) sopra le pupe senza toccarli. Posizionare piccole goccioline (circa 0,5 µ l) di soluzione di glicerolo al 50% ogni caso pupal aprono il coprioggetto usando una pipetta di 20 µ l di cui sopra. Nota: Questa procedura assicura che le goccioline hanno la stessa spaziatura le pupe.</li>
		<li>Capovolgere il vetrino coprioggetto e posizionarlo sopra le pupe a mano o con forcipe (standard #5) mentre ci si riposa un lato del coprivetrino su lamelle distanziale accanto le pupe. Successivamente, dolcemente cadere il coprioggetto sulle pupe. Assicurarsi che le aperture di caso pupale correttamente vengono coperte con 50% glicerolo per la buona qualità delle immagini e per impedire le pupe asciugarsi.</li>
		<li>Piegare oltre un'estremità di un pezzo di nastro adesivo e afferrarla con la pinzetta (standard #5) a tal fine. Posizionare delicatamente il nastro che si estende su un bordo del coprivetrino superiore, il coverslip(s) distanziale e scivolo di plastica su un lato. Non premere verso il basso il nastro, ancora. In primo luogo, girarsi la diapositiva e ripetere per l'altro lato.</li>
		<li>Utilizzare entrambi i dito indice per premere verso il basso il nastro contemporaneamente su entrambi i lati. Questa procedura assicura che le pupe non sono sfollate.</li>
		<li>Controllare che le pupe siano bene a contatto con il vetrino coprioggetti. Per la qualità delle immagini ottima le pupe dovrebbero essere spremute delicatamente sotto il vetrino coprioggetti. Se necessario, regolare il numero di vetrini coprioggetti distanziale.</li>
		<li>Etichettare la diapositiva di scrittura sul nastro appiccicoso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. live Imaging delle pupe
<ol><li>Il metodo di montaggio consente di formazione immagine delle pupe Microscopi rovesciati (Figura 1I) sia su microscopi (Figura 1J). Particolarmente adatto per formazione immagine diretta esegue la scansione di microscopi confocali, due-fotone microscopi e microscopi confocali di filatura disco indipendentemente dal fatto se essi sono invertiti o in posizione verticale. Per i film a lungo termine, è necessario utilizzare una fase temperatura controllata se disponibile.</li>
	<li>Utilizzando l'oculare e una lampada UV o trasmissione luce, individuare una pupa e un fuoco dentro la pupa.</li>
	<li>Con la fotocamera, trovare la struttura desiderata e regolare il livello di zoom.</li>
	<li>Per i film a lungo termine, definire un z-stack che comprende la struttura di interesse ben (ad esempio, i muscoli di volo indiretto, loro siti di attaccamento, le cellule del tendine o una combinazione del suddetto) e scegliere un intervallo di tempo. Prendere in considerazione facendo una media per una migliore qualità di immagine. Per i film ad alta velocità, a breve termine, scegliere un singolo z-aereo per raggiungere un frame rate elevato.</li>
	<li>Regolare la potenza del laser per dare il miglior segnale possibile ma poco saturazione. Tuttavia, anche ad alta potenza laser può danneggiare la pupa nel corso del tempo.</li>
	<li>Avviare imaging e tornare di tanto in tanto controllare il film e riadattare il posizionamento dello stack z se necessario.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro per formazione immagine dal vivo della morfogenesi muscolo-tendinee in Drosophila pupe. Vedi protocollo per dettagli. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).</li><li>Venken, K. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> eLife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+signaling+induces+nautilus+expression+in+the+ventral+mesoderm+of+the+Drosophila+embryo.">Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).</li><li>Roy, S., Raghavan, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeotic+genes+and+the+regulation+of+myoblast+migration,+fusion,+and+fibre-specific+gene+expression+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila.</a> Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).</li><li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).</li><li>Gordon, S., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+calcium+in+the+regulation+of+mechanical+power+in+insect+flight.">Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Screens+for+In+Vivo+Tinman+Binding+Sites+Identify+Cardiac+Enhancers+with+Diverse+Functional+Architectures.">Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).</li><li>Chen, E. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisocial,+an+intracellular+adaptor+protein,+is+required+for+myoblast+fusion+in+Drosophila.">Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila.</a> Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).</li><li>Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Tagging+Drosophila+Proteins+at+Their+Native+Genomic+Loci+With+Small+P+Elements.">Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements.</a> Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).</li><li>Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Sch&#246;ck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alp/Enigma+Family+Proteins+Cooperate+in+Z-Disc+Formation+and+Myofibril+Assembly.">Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).</li><li>Klapholz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+for+talin+to+mediate+integrin+function.">Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function.</a> Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).</li><li>Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+protein+Kon-tiki+couples+to+Dgrip+to+mediate+myotube+targeting+in+Drosophila.">The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila.</a> Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).</li><li>Menon, S. D., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+rolling+pebbles:+a+multidomain+protein+required+for+myoblast+fusion+that+recruits+D-Titin+in+response+to+the+myoblast+attractant+Dumbfounded.">Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded.</a> Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).</li><li>Bloor, J. W., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zipper+Nonmuscle+myosin-II+functions+downstream+of+PS2+integrin+in+Drosophila+myogenesis+and+is+necessary+for+myofibril+formation.">zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation.</a> Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135 (4), 621-626 (2008).</li><li>Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood+brain+barrier+is+maintained+by+GPCR-dependent+dynamic+actin+structures.">The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures.</a> J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+a+Repressible+Cell+Marker+for+Studies+of+Gene+Function+in+Neuronal+Morphogenesis.">Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>F&#246;rster, D., Luschnig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src42A-dependent+polarized+cell+shape+changes+mediate+epithelial+tube+elongation+in+Drosophila.">Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila.</a> Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).</li><li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology.">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li><li>Weitkunat, M., Kaya-&#199;opur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+and+force-resistant+attachment+are+essential+for+myofibrillogenesis+in+Drosophila+flight+muscle.">Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle.</a> Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).</li><li>Guirao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+quantitative+characterization+of+epithelial+tissue+development.">Unified quantitative characterization of epithelial tissue development.</a> eLife. 4, e08519 (2015).</li><li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+and+spontaneous+muscle+twitching+precede+the+formation+of+cross-striated+muscle+in+vivo.">Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo.</a> Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).</li><li>Sellin, J., Albrecht, S., K&#246;lsch, V., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+heart+differentiation,+visualized+utilizing+heart+enhancer+elements+of+the+Drosophila+melanogaster+bHLH+transcription+factor+Hand.">Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand.</a> Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).</li><li>Lemke, S. B., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+during+muscle+development.">Mechanical forces during muscle development.</a> Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).</li><li>Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease.">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li><li>Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+two-step+CRISPR-+and+RMCE-based+strategy+for+efficient+genome+engineering+in+Drosophila.">A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila.</a> G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato descrive come immagine morfogenesi muscolo-tendinee in vita Drosophila pupe utilizzando una varietà di proteine fluorescente etichettate. Questo in vivo imaging strategia può essere utilizzato per studiare i processi di sviluppo nel loro ambiente naturale dell'intero organismo.
È fondamentale per un esperimento riuscito trovare il punto corretto tempo inerente allo sviluppo per analizzare. Ad esempio, i muscoli di volo indiretto di dorsolongitudinal avviare attaccamento verso i loro obiettivi di tendine a ≈16 h APF23 mentre i muscoli addominali si sviluppano più tardi e allegare su entrambe le estremità solo tra 30 e 40 h APF26. Di conseguenza, la letteratura precedentemente pubblicata deve essere utilizzato per trovare i punti di momento di sviluppo per analizzare o, se il tessuto o la struttura di interesse non è stato studiato in dettaglio prima, lo sviluppo complessivo deve essere caratterizzato in primo luogo.
Per pupe di montaggio con successo sui vetrini in plastica su misura, è importante che le scanalature hanno dimensioni idonee: la necessità di scanalature di essere 1,0-1,5 mm larga e 0,3 - 0,4 mm di profondità. Questa profondità permette di regolare la distanza precisa per il coprioggetto superiore con distanziale coprioggetti come necessario. Tuttavia, almeno un vetrino coprioggetti distanziatore dovrebbero essere utilizzato per evitare un consumo eccessivo del glicerolo di 50% dal campione da forze capillari. Il corretto posizionamento delle pupe nella scanalatura richiede alcune esperienza e dovrebbe essere ottimizzati tale che la struttura di interesse è il più vicina possibile per il vetrino coprioggetti.
Se un gran numero di pupe è supposto per essere imaged in sessione uno microscopio, possono tutti essere montati in anticipo e poi conservati in un incubatore fino imaging per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Le pupe dovrebbero sopravvivere l'intera procedura e anche almeno cercare di eclose se mantenuto sulla diapositiva dopo formazione immagine. Il tasso di sopravvivenza può essere utilizzato come una lettura per verificare se le condizioni di imaging danneggiano le pupe.
Le impostazioni di imaging dovrebbero essere scelti con cura secondo i requisiti sperimentali. Per i film a breve termine, un frame rate elevato contro un elevato rapporto segnale-rumore deve essere bilanciata, mentre relativamente ad alta potenza laser può essere utilizzato senza danneggiare troppo le pupe. Tuttavia, per i film a lungo termine, la potenza del laser deve essere mantenuto ad un livello moderato e le pupe non dovrebbero essere imaged continuamente ma piuttosto a determinati punti di tempo, ad esempio, ogni 20 min. Per garantire che la struttura di interesse non si muove fuori del campo di vista, potrebbe essere necessario riadattare il posizionamento dello z-stack tra intervalli di tempo. A nostra conoscenza, l'apertura del caso pupal non pregiudica per sé tempistica inerente allo sviluppo. Tuttavia, una fase di temperatura controllata dovrebbe essere utilizzata per i film a lungo termine per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Tenendo presenti queste considerazioni, film altamente informativo può essere acquisito.
Il protocollo presentato consente di visualizzare non solo morfogenesi muscolo-tendinee, ma anche altri tessuti in via di sviluppo, ad esempio, l'ala epitelio29. Sono necessarie solo tre modifiche al presente protocollo: (1) l'apertura del caso pupal sopra l'ala invece il torace o dell'addome, (2) posizionamento di pupe con l'ala verso il coprioggetto superiore e (3) l'uso di proteine differenti marcatore fluorescente. Con l'avanzamento della CRISPR/Cas9-tecnologia, sempre più in modo endogeno con tag proteine fluorescenti sarà disponibile, perché è diventato più semplice per indirizzare endogeni loci nella Drosophila30,31 , 32. in futuro, questo vi permetterà di chiarire le dinamiche di numerose proteine, cellule e tessuti intero nel loro ambiente fisiologico in dettaglio.

L'apparato muscolo-tendinee permette animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. I mattoni molecolari del sistema muscolo-tendinee sono altamente conservati. Di conseguenza, concetti di sviluppo muscolo-tendinee pertinente per la biologia del muscolo umano, ad esempio la morfogenesi del muscolo, muscolo-tendinee attaccamento e autorganizzazione Miofibrilla, possono essere studiati utilizzando Drosophila melanogaster come un facilmente accessibile modello di sistema. Il sistema di pupal Drosophila ha diversi vantaggi sperimentali. In primo luogo, nella fase pupal – quando si formano i muscoli adulti – l'organismo è sessile e quindi facile da immagine su un microscopio su un periodo di ore o addirittura giorni. In secondo luogo, forma molti muscoli abbastanza sotto la superficie pupal vicino così che essi possono essere imaged all'interno dell'organismo intatto, parzialmente traslucido. In terzo luogo, i muscoli possono essere studiati nel loro ambiente naturale, dove sono collegati per l'esoscheletro formatura tramite le cellule del tendine e si costruisce la tensione dei tessuti. Questo non è possibile in sistemi di colture cellulari del muscolo. E infine, una pletora di strumenti genetici è disponibile in Drosophila. Tra questi ci sono molti marcatori fluorescente con tag che permettono di etichettatura di tipi cellulari specifici o strutture subcellulari per l'imaging in vivo.
La tabella 1 riassume i più importanti marcatori utilizzati per lo studio della morfogenesi muscolo-tendinee. Esso comprende marcatori sovraespressi utilizzando il sistema GAL4-UAS1 e in modo endogeno con tag proteina marcatori2,3,4. Il vantaggio del sistema GAL4-UAS è che i marcatori sono generalmente espressi ad alti livelli, risultante in un segnale forte che può facilmente essere imaged in intero-monta pupe. Inoltre, tessuto specificità può essere ottenuta scegliendo con cura i driver GAL4. Il vantaggio delle proteine di fusione espresso sotto controllo endogeno è che la dinamica delle rispettive proteine può essere studiato in vivo, mentre può essere utilizzati anche come marcatori per diversi tipi di cellule o specifiche strutture subcellulari, ad esempio, ΒPS-integrina-GFP per siti di attacco del muscolo. Insieme, questi indicatori forniscono elevata flessibilità nel disegno sperimentale e la scelta dei problemi di ricerca che può essere risolto ora e in futuro.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Struttura con etichetta</td>
			<td colspan="2">Marcatore</td>
			<td colspan="2">Espressione e localizzazione</td>
			<td colspan="2">Classe</td>
			<td colspan="2">Numero di azioni</td>
			<td colspan="2">Commento</td>
			<td>Rif.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Muscolo</td>
			<td colspan="2">
MEF2-GAL4</td>
			<td colspan="2">tutti i mioblasti e tutti i muscoli in tutte le fasi</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">precursori del muscolo adulto e primi miotubi fino alle h ≈24 APF</td>
			<td colspan="2">Linea di Gal4, trappola enhancer</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">salto del muscolo su differenziazione</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Act88F enhancer / promotore guida 3.1 Cameleon</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Indicatore di CA2 +</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 e fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Lui- nls-GFP</td>
			<td colspan="2">precursori del muscolo adulto, nucleari, fino al ≈24 h APF nei muscoli di volo indiretto</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promotore con reporter nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">frammento del rinforzatore di 1,5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubuli in modelli di DLM e nella differenziazione di muscoli</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promotore con reporter Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubuli in miotubi (ad es. nei muscoli di volo indiretto da ≈14 h AFP, diminuendo fortemente dopo ≈48 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomeri (filamento spesso) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">utilizzare eterozigoti, un sottoinsieme di isoforma di etichette</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomeri (Z-disco) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, uso eterozigotico</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco in tutti i muscoli del corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco in tutti i muscoli del corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di actina; espresso in miotubi, mioblasti e dell'epitelio</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">giunzioni delle cellule epiteliali, mioblasti e membrane nei muscoli in tutte le fasi</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Luogo del collegamento del muscolo</td>
			<td colspan="2">ΒPS-integrina-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-knock-in</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP e - mCherry</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (MiMIC linea)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Ilk-GFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP e - RFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (transgene)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendine</td>
			<td colspan="2">
Sr-GAL4</td>
			<td colspan="2">cellule del tendine di torace, durante fase pupal</td>
			<td colspan="2">Linea di Gal4, trappola enhancer</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">omozigotica letale</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Muscolo e tendine</td>
			<td colspan="2">
DUF-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscoli ed epiteli, esordio precoce</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">Kirre-rP298, indicatore di cella del fondatore</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-reporter</td>
			<td colspan="2">
UAS- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">dominio legante l'actina di moesina fusa alla GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA fusa a mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">varie azioni, ad esempio: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 27391 e 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-Palma-mCherry</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana attraverso palmitoilazione</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Etichetta fluorescente proteine marker adatto per lo studio del muscolo-tendine morfogenesi in vivo.
Qui, descriviamo dettagliatamente come formazione immagine della morfogenesi muscolo-tendinee in pupe vivente può essere eseguita facilmente e con successo (Figura 1). In alternativa, possono essere fissati pupe, sezionato e immunostained, che consente l'utilizzo di anticorpi per etichettare anche proteine per cui no vivo marcatori sono disponibili22. In questo caso, la qualità delle immagini è generalmente superiore perché non c'è nessun movimento e la struttura di interesse può essere collocata in prossimità del vetrino coprioggetti. Tuttavia, la dissezione e la fissazione può portare a danni e molecolari o dinamiche di tessuto, per esempio, spasmi muscolari, può essere studiato solo nell'organismo vivente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>product has been replaced by Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fly food in bottles (or vials)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>standard culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brush</td>
			<td>da Vinci</td>
			<td>1526Y</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VWR: 631-1303</td>
			<td>76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape (optional)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6651263</td>
			<td>12 mm x 6.3 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632102</td>
			<td>94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper tissues</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7695251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>straight tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic slides with a groove (reusable)</td>
			<td>custom-built</td>
			<td>-</td>
			<td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107032</td>
			<td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49781</td>
			<td>dilute to 50 % in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adhesive tape</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>57370-02</td>
			<td>1.5 mm x 10 m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Muscoli insieme lo scheletro e tendini permettono animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. Morfogenesi del muscolo è altamente conservata dagli animali agli esseri umani. Di conseguenza, il potente sistema di modello di Drosophila utilizzabile per approfondire concetti di sviluppo muscolo-tendine che può essere applicato anche alla biologia del muscolo umano. Qui, descriviamo dettagliatamente come morfogenesi del sistema muscolo-tendinee adulto può essere facilmente imaged in vita, lo sviluppo di Drosophila pupe. Quindi, il metodo consente di indagare le proteine, cellule e tessuti nel loro ambiente fisiologico. Oltre a un protocollo di passo-passo con consigli utili, forniamo una panoramica completa delle proteine marker fluorescente contrassegnati che sono adatti per lo studio del sistema muscolo-tendinee. Per evidenziare le applicazioni del protocollo, abbiamo Visualizza esempio film che vanno dalla visualizzazione degli eventi morfogenetici a lungo termine – che si verificano sulla scala del tempo di ore e giorni – visualizzazione di processi dinamici a breve termine come contrazioni muscolari che si verificano su scala di tempo di secondi. Presi insieme, questo protocollo dovrebbe consentire al lettore di progettare ed eseguire esperimenti live-imaging per indagare la morfogenesi del muscolo-tendine nell'organismo intatto.

Vari tessuti possono essere imaged in vivo nello sviluppo pupe volare, che li rende un sistema modello ideale per studiare la morfogenesi di organi adulti. Tra questi sono i muscoli di volo indiretto, l'epitelio di torace, comprese le cellule del tendine, l'epitelio dell'ala, muscoli addominali e il cuore22,23,24,25,26 , 27. qui, ci concentriamo su formazione immagine dal vivo della morfogenesi del muscolo e tendine. Per una descrizione dettagliata del muscolo voli indiretti e morfogenesi dei muscoli addominali e ulteriori metodi per lo studio della biologia del muscolo in Drosophila, rimandiamo il lettore a Weitkunat e Schnorrer 201422.
Live imaging dei muscoli di volo indiretto
Per studiare lo sviluppo a lungo termine dei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs) e i muscoli dorsoventral (DVMs), moesina globulare actina-associazione dominio contrassegnato con GFP (UAS -GFP-Gma) è stata espressa in tutte le i muscoli utilizzando il fattore di rinforzatore del Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 driver (Figura 2A-D, Film S1). Prima di formazione immagine, è stata aperta una finestra nel caso pupal sopra il torace come mostrato in Figura 1F. Su un microscopio a due fotoni, z-stack sono stati acquisiti ogni 20 min per h 21 a partire da ≈11 h dopo la formazione del pupario (11h APF). In questo lasso di tempo, la DLMs (verde sovrapposizioni nella Figura 2A'-D') prima di avviare collegamento alle cellule del tendine (Figura 2A) e quindi di dividere mentre gli allegati muscolari mature (Figura 2B). Successivamente, i miotubi accorciano (Figura 2) fino a raggiungere infine la fase compattata al massimo a 30 h APF (Figura 2D). Presi insieme, questo film mette in evidenza i drammatici cambiamenti nella morfologia del muscolo che si verificano sulla scala del tempo di ore.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Figura 2: Live imaging della morfogenesi di muscolo e tendine di voli indiretti. (A-D) Punti da un filmato di due fotoni (film S1) utilizzando Mef2tempo-GAL4, UAS- GFP-Gma come marcatore per l'actina nei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs, evidenziata in verde nell'A '-D') e la (muscoli dorsoventral DVMs, evidenziata in blu nell'A '-D'). Barre della scala sono 100 µm. (E-H) tempo punti da un filmato di due fotoni (film S2) utilizzando Duf-GAL4UAS-CD8-GFP come indicatore per i muscoli di volo indiretto e l'epitelio di torace compreso le cellule del tendine. Pannelli E'-H' mostrare una sovrapposizione con un modello del sistema muscolo-tendinee in ogni punto del tempo, evidenziando le estensioni lungo cellulare formata dall'epitelio del tendine (magenta) a contatto con i muscoli (verde). Barre della scala sono 100 µm (stimato dalla dimensione delle strutture imaged). (I-L) Tempo punti da un film di confocal di due colori, filatura disco (film S3) concentrandosi sull'iniziazione allegato muscolo-tendinee. Le cellule del tendine sono etichettate con sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) e il dorsolongitudinal indiretta volo muscoli con Mhc -Tau-GFP (green). Barre della scala sono 10 µm. tempo è indicato come HH: mm dopo formazione pupario (APF). Si noti che non tutti i film sono stati acquistati su un palco a temperatura controllata, pertanto, può divergere tempistica inerente allo sviluppo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per lo studio della morfogenesi del tendine e del muscolo allo stesso tempo, membrana-limita GFP (UAS -CD8-GFP) è stato espresso utilizzando Dumbfounded (Duf)-GAL4 come un driver, che si esprime sia nelle cellule del tendine e i muscoli di volo indiretto (Figura 2E -H, film S2). Uno z-stack è stata presa su un microscopio a due fotoni ogni 20 min a partire a 16 h APF per 20 h. Mentre i miotubi compatto (sovrapposizione verde in Figura 2E'-H'), il tendine cellule estensioni lungo cellulare modulo che allungano con tempo (magenta sovrapposizione in Figura 2E'-H'). Presi insieme, questo film mette in evidenza la stretta interazione tra il tendine e muscolo cellule in vivo.
Per studiare l'interazione muscolo-tendinee più in dettaglio, due colori, ad alto ingrandimento imaging è stata eseguita. Pupe con catena pesante della miosina (Mhc)-Tau-GFP nella DLMs e UAS -palmitoilazione-mCherry (UAS -palm-mCherry) guidato da striscia (sr)-GAL4 nei tendini erano imaged ogni 5 min a partire da 12 h APF per 4,5 h su un disco che gira microscopio confocale (Figura 2I-L, film S3). A 12 h APF, i miotubi migrano verso loro cellule bersaglio del tendine formando lungo filopodi sulla loro punta (Figura 2I). Successivamente, i muscolo e tendine tessuti interdigitazione (Figura 2J, K) per formare un collegamento stabile. Come l'allegato matura, meno filopodi modulo e l'interfaccia muscolo-tendinee leviga (Figura 2 L). Così, due colori, ad alto ingrandimento imaging consente di rivelare la dinamica cellulare in dettaglio nell'organismo vivente.
Live imaging dei muscoli addominali
Per formazione immagine diretta dei muscoli addominali (Figura 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP è stato usato come un indicatore e una finestra è stata aperta sopra l'addome nel caso pupal come descritto in dettaglio nella Figura 1. Simile al film di muscolo voli indiretti rappresentato in Figura 2A-D, la formazione e la crescita dei muscoli addominali possono essere seguite su molte ore di sviluppo (55H nel film S4). Durante questo periodo, i mioblasti fusibile per formare miotubi (Figura 3A) in crescita. I suggerimenti di miotubi migrano verso i loro obiettivi di tendine, e dopo il collegamento per le cellule del tendine, si formano le unità contrattile dei muscoli, i sarcomeri, (Figura 3B-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Figura 3: Live imaging della morfogenesi del muscolo addominale. (A-D) Punti da un filmato (Movie S4) utilizzando Mef2tempo-GAL4UAS-CD8-GFP come marcatore di seguire la morfogenesi dei muscoli addominali. Pannelli A'-E' mostrare sovrapposte con modelli di un insieme di muscoli addominali (verde) che si forma de novo durante la fase di pupa. Barre della scala sono 100 µm. tempo è indicato come HH: mm APF. Il film è stato acquisito a temperatura ambiente. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Live imaging di contraendo i muscoli
In contrasto con la Figura 2 e Figura 3, Figura 4 Mostra dinamiche muscolari che si verificano sulla scala del tempo di secondi: la registrazione dal vivo di contrazioni muscolari. Pupe esprimendo βPS-integrina-GFP sotto controllo endogeno erano imaged con una risoluzione temporale di 0.65 s in un unico piano z su un microscopio confocale (Film S5). Nell'esempio visualizzato nella Figura 4, i siti di collegamento di tre DVMs (Figura 4A) erano imaged per 10 min a partire da 42 h APF. Durante questo tempo, twitch cinque eventi sono stati osservati (fig. 4B-F), mostrando che i sarcomeri sono già assemblati abbastanza bene per sostenere sviluppo coordinate contrazioni in questo momento. Quindi, imaging di contrazioni muscolari può essere utilizzato come una lettura funzionale per sarcomerogenesis già durante lo sviluppo del muscolo voli indiretti28, al contrario ad esempio prove di volo, che può essere eseguita solo dopo eclosion.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Figura 4: Live imaging di contraendo i muscoli. (A) primo tempo-punto da un filmato (Movie S5) mostrando contrazioni dei muscoli dorsoventral voli indiretti alle 42h APF utilizzando βPS-integrina-GFP come indicatore. Nel campo di vista è il muscolo allegato siti DVM II 2, DVM III 1 e DVM III 2. (B-F) Colore sovrapposizioni di cinque eventi di twitch individuali, ognuna mostrando il telaio prima della contrazione (magenta) e il primo fotogramma dell'evento twitch (verde). Si noti che le singole fibre di muscolo contrarsi in modo indipendente gli uni dagli altri. Le frecce evidenziano il movimento contrazioni. La risoluzione di tempo del film è 0,65 s. barre della scala sono 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Live imaging di proteine etichettate in modo endogeno
Simile a βPS-integrina-GFP, una grande collezione di proteine di fusione espressa in Drosophila sotto controllo endogeno è stato generato2,3,4. Queste linee di volare possono essere utilizzate per studiare ad esempio la localizzazione subcellulare o i profili di espressione di proteine di interesse. La collezione è particolarmente utile se gli anticorpi specifici non sono disponibili o proteina dinamiche devono essere studiati in vivo senza fissazione. Figura 5 vengono illustrati tre esempi di proteine di fusione in modo endogeno espresse dalla libreria TransgeneOme (fTRG) Vola, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figura 5A, B), Talin-GFP (Figura 5, D) e βTubulin60D-GFP ( Figura 5E, F). L'espressione di queste proteine può essere studiata in tutti i tessuti che li esprimono naturalmente. Qui, indichiamo l'epitelio del torace (Figura 5AC, E) e i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato (figura 5BD, F) come esempi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Figura 5: Live imaging di endogenamente etichetta proteine. (A, B) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo Hts-GFP. (C, D) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo la Talin-GFP. (E, F) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo βTubulin60D-GFP. Pannelli A, C ed E mostrare l'epitelio del torace a 18, 24 e 18 h APF, rispettivamente e pannelli B, D e F mostrare i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato a 30 h APF. Barre della scala sono 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Qui, presentiamo un metodo facile da usare e versatile per eseguire dal vivo imaging dei processi di sviluppo nella morfogenesi generale e muscolo-tendinee in particolare nella vita della drosofila pupe.

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

The overall goal of this procedure is to study muscle-tendon morphogenesis in living Drosophila pupae.This method can help answer key questions in the muscle development field.Such as how muscle cells interact with their tendon targets, and when they acquire the ability to twitch.The main advantage of this method is that muscle-tendon morphogenesis can be studied in the intact organism, and over many hours.To begin the protocol, use a wet brush to collect white pre-pupae from the walls of the bottles of fly stocks, and transfer them to a glass slide.Next, under a stereo microscope, remove clumps of fly food sticking to the pupae with a wet brush, and orient the ventral side of the pupae towards the glass slide.Discard the pupae that have started to turn brown, or that are still moving.Label the glass slide with the genotype, date and time of collection.Transfer the slide to a Petri dish and add a wet tissue to prevent the pupae from drying out.Store the pupae in an incubator at 25

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. The overall goal of this procedure is to study muscle-tendon morphogenesis in living Drosophila pupae.This method can help answer key questions in the muscle development field.Such as how muscle cells interact with their tendon targets, and when they acquire the ability to twitch.The main advantage of this method is that muscle-tendon morphogenesis can be studied in the intact organism, and over many hours.To begin the protocol, use a wet brush to collect white pre-pupae from the walls of the...

Video: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...