La forza estensore del ginocchio è un risultato funzionale comune valutato nella ricerca clinica. Tuttavia, i metodi per valutare ripetutamente il muscolo estensore del ginocchio, in particolare la forza del quadricipite, negli studi sui roditori sono stati relativamente limitati. Questo protocollo non invasivo può essere utilizzato per misurare la coppia tetanica di picco isometrica degli estensori del ginocchio nei topi e può essere ripetuto longitudinalmente.
I nostri metodi supportano lo sviluppo di modelli pre-clinici per migliorare il recupero a seguito delle lesioni o in pazienti con osteoartrite. Data l'ampiezza dei modelli di roditori sviluppati per studiare gli esiti muscoloscheletrici a seguito di lesioni al ginocchio o osteoartrite, esiste la necessità di una valutazione non invasiva della forza del quadricipite. La dimostrazione visiva è fondamentale per l'integrità dei dati in quanto dimostreremo come posizionare in modo ottimale gli elettrodi per stimolare al massimo gli estensori del ginocchio.
Prima di iniziare l'esperimento, verificare che tutte le macchine siano collegate secondo le specifiche del produttore. Collegare il motore a leva muscolare a doppio carico con l'apparato di estensione del ginocchio alla piattaforma animale e accendere la pompa dell'acqua a 37 gradi Celsius, quindi accendere il computer, lo stimolatore bifase ad alta potenza e il sistema a leva a doppia modalità a 2 canali e aggiungere isoflurano al vaporizzatore alla linea di riempimento massima. Per ottimizzare il posizionamento della sonda, nel software dello strumento selezionare Prepara esperimento e Configura stimolo istantaneo e impostare la frequenza di impulso su 125 Hertz, la larghezza di impulso su 0,2 metri al secondo, il numero di impulsi su uno, la frequenza del treno su 0,5 Hertz e il tempo di esecuzione su 120 secondi.
Quindi, selezionare File e aprire Live Data Monitor. Per eseguire esperimenti di contrazione e frequenza di coppia, selezionare uno studio di programma precedente che includa gli esperimenti appropriati di frequenza di coppia di contrazione ed estensione del ginocchio. Selezionare il mouse sperimentale appropriato o Aggiungi nuovo animale e fornire le informazioni del mouse corrispondenti da conservare con i dati di coppia.
Quindi, selezionate Esperimento successivo o Esperimento precedente per passare dal protocollo twitch alla sequenza di frequenza di forza. Dopo l'anestesia, confermare la sedazione da una mancanza di risposta al riflesso del pedale e posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma riscaldata con la testa e un cono nasale. Utilizzare tosatrici elettriche per radere i capelli dall'arto posteriore destro.
Dopo aver pulito i capelli dal mouse e dalla piattaforma, stringere saldamente l'arto posteriore superiore al ginocchio. Dopo il serraggio, posizionare l'arto posteriore inferiore nell'apparato di estensione del ginocchio con la tibia anteriore che tocca leggermente il pezzo di plastica regolabile e avvolgere il nastro chirurgico attorno alla parte inferiore del pezzo di plastica regolabile per fissare la gamba all'apparecchio, quindi regolare le manopole sulla piattaforma fino a quando il ginocchio non è piegato con un angolo di 60 gradi, e posizionare un pezzo di nastro adesivo sul busto del mouse per evitare movimenti compensatori con estensione massima del ginocchio. Posizionare l'elettrodo per via sottocutanea da due a quattro millimetri prossimale al ginocchio direttamente sopra i quadricipiti e i muscoli estensori del ginocchio a circa uno o due millimetri di distanza.
Per determinare il posizionamento ottimale dell'elettrodo, nel software, selezionare Instant Stimulation e Live Data Monitor e impostare la corrente su 50 milliampere per contrazioni ripetute per confermare l'estensione come indicato da una curva di contrazione negativa. Per ottenere la massima coppia di contrazione dell'estensione del ginocchio, regolare le sonde durante la revisione della risposta nella finestra di Live Data Monitor. Durante la somministrazione di contrazioni ripetute con stimolazione istantanea, palpare i muscoli flessori del ginocchio del topo con l'indice per confermare che non vi è alcuna attivazione dei muscoli antagonisti.
Per la massima stimolazione dell'estensore del ginocchio, riposizionare le sonde secondo necessità. Quando è stato determinato il posizionamento ottimale della sonda, impostare la corrente a 50 milliampere e selezionare Esegui esperimento per produrre una singola contrazione. Selezionate Analizza risultati (Analyze Results) per visualizzare la coppia erogata e registrare la coppia di contrazione visualizzata in Forza massima con la linea di base sottratta.
Ripeti l'esperimento dimostrato fino a quando la coppia di contrazione non si stabilizzi o inizi a diminuire. Aumentare la corrente a 10-20 milliampere e registrare la coppia di contrazione per ogni esperimento. Registrare la corrente più bassa alla quale viene raggiunta la coppia di contrazione più elevata.
Questa corrente verrà utilizzata per l'esperimento della frequenza di forza. Per determinare l'effetto di coppia tetanica isometrica di picco, selezionare l'esperimento di frequenza di coppia pre-programma per l'estensione del ginocchio e impostare la durata dello stimolo su 0,35 secondi, le sequenze di frequenza su 10, 40, 120, 150, 180 e 200 Hertz e il periodo di riposo tra gli impulsi e le contrazioni a 120 secondi. Quindi, fare clic su Esegui esperimento e analizza risultati e registrare manualmente la coppia a ciascuna frequenza, assicurandosi che il canale forza sia invertito poiché la contrazione dell'estensore del ginocchio produrrà una coppia negativa.
Si noti il valore di forza massima più alto come coppia tetanica isometrica di picco. Alla fine dell'esperimento di frequenza di coppia, eseguire una contrazione di follow-up e confrontare la contrazione di follow-up con la contrazione di picco iniziale alla stessa corrente per valutare il danno o l'affaticamento. Quando tutte le misurazioni della coppia sono state acquisite, rimuovere delicatamente le sonde dell'elettrodo e bloccare dal ginocchio e posizionare il mouse in una gabbia di recupero su un cuscinetto termico con monitoraggio fino alla completa reclinazione.
In questa analisi rappresentativa, sono state introdotte tre contrazioni isolate a una stimolazione iniziale di corrente di 10 Hertz. La fusione a contrazione parziale è stata osservata a 40 Hertz e la coppia tetanica di picco è stata raggiunta a 120-180 Hertz. In questo esperimento, sono state ottenute curve di frequenza della coppia di estensione del ginocchio per tre topi al tempo zero e due settimane dopo la valutazione iniziale.
Come osservato, i valori di coppia grezzi e i valori di coppia grezzi normalizzati al peso corporeo del topo erano statisticamente simili in entrambi i punti temporali confermando la riproducibilità dell'analisi. Come illustrato in quest'area sotto l'analisi della curva utilizzando i dati di coppia isometrica normalizzati del peso corporeo per esperimenti completi di frequenza di coppia per quattro topi separati, una coppia totale simile è stata ottenuta dopo ripetute analisi con gli stessi animali. La coppia tetanica di picco ha anche dimostrato una variabilità minima all'interno di ciascun animale.
Il protocollo di coppia tetanica di picco dell'estensore del ginocchio è uno strumento utile per rilevare le differenze di forza in più modelli murini. Ad esempio, in questa analisi, si può osservare un netto contrasto tra la forza dell'estensore del ginocchio e un topo wild-type non ferito e un modello murino transgenico di ipertrofia soprafisiologica. Inoltre, un calo di quasi il 50% della coppia di picco è stato osservato negli animali selvatici sette giorni dopo la trasezione chirurgica del legamento crociato anteriore.
Il posizionamento ottimale dell'elettrodo è fondamentale per ottenere risultati significativi e ripetibili. L'affaticamento del muscolo estensore del ginocchio è un importante indicatore della funzione fisica, comprese le contrazioni submassimali ripetute e le valutazioni future aggiungerebbero ulteriore rilevanza traslazionale a questo metodo nei modelli pre-clinici. Gli studi che studiano i meccanismi di adattamento muscolare, spesso utilizzano modelli murini a causa della semplicità della modificazione genetica.
Questa tecnica offre un metodo non invasivo per misurare ripetutamente la funzione estensore del ginocchio in vivo in questi modelli pre-clinici.
