Offriamo un delicato processo bioprinted per la preparazione di microcarrier con una buona controllabilità e biocompatibilità. Dopo l'incapsulamento da parte delle cellule, i supporti possono anche essere utilizzati nell'espansione cellulare in vitro e nella costruzione funzionale di microtessuti. Lo spostamento limitato, piuttosto che forze gravi in condizioni simili, agiscono sull'ugello durante il processo di stampa, mantenendo al massimo le proprietà fisico/chimiche originali del bio-inchiostro.
Oltre ai microcarrier convenzionali, le unità con distribuzione cellulare interna o strutture di capsule incapsulate in tritosina possono essere costruite e applicate all'assemblaggio di diverse strutture tissutali. Per la preparazione dell'ugello, caricare micropipette di vetro sull'estrattore secondo le istruzioni del produttore e impostare i parametri di trazione per l'estrattore. Utilizzare un microforge per tagliare l'ugello al diametro designato per ottenere il diametro specifico della punta per l'esperimento e sterilizzare l'ugello in alcool per cinque minuti.
Quindi, risciacquare l'ugello tre volte con acqua sterile per rimuovere eventuali residui di alcol. Per preparare il bio-inchiostro idrogel, diluire la soluzione madre di alginato di sodio al 4% sterilizzata in cloruro di sodio allo 0,9% a concentrazioni di 0,5, 1, 1,5 e 2% peso per volume. Per la formazione di microgoccioline, caricare cinque millilitri di bio-inchiostro in una siringa sterile monouso e installare la siringa su una pompa a siringa.
Utilizzando un tubo flessibile di un millimetro di diametro interno, collegare la siringa e l'ugello di stampa. Stringere la vite di serraggio per fissare l'ugello in posizione e premere rapidamente la pompa della siringa per caricare il bio-inchiostro nell'ugello. Impostare i parametri del generatore di segnali e preimpostare il percorso del movimento e la modalità di attivazione della vibrazione per cadere su richiesta.
Quindi stampare le goccioline seguendo i modelli pre-progettati. Per la formazione di microcarrier, aggiungere cinque millilitri di soluzione reticolante a una capsula di Petri e posizionare la parabola sotto l'ugello di stampa come substrato. Dopo la stampa, reticolare i microcarrier per tre minuti prima di trasferire la sospensione del microvettore su un tubo della centrifuga.
Quindi, arricchire i microcarrier mediante centrifugazione e risospenderli in un terreno di coltura appropriato a circa 600 microcarrier per millilitro. Prima della loro inoculazione, sostituire il surnatante di una coltura cellulare A549 con cinque millilitri di mezzo privo di siero integrato con colorante CMFDA verde tracker cellulare 10 micromolari per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di colture cellulari. Alla fine dell'incubazione, sostituire la soluzione colorante con mezzo fresco e risospese le cellule ad una densità di 1,6 volte 10 alle sei cellule per millilitro di mezzo.
Aggiungere un millilitro di sospensione di microcarrier alle celle e un millilitro di celle A549 a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti a bassa aderenza. Posizionare la piastra su uno shaker nell'incubatore di colture cellulari a 30 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la piastra dallo shaker e lasciare che i microcarrier si depositino per 30 minuti prima di osservare e misurare l'ugello di stampa, le piastre di Petri e le cellule inoculate da microvettore mediante microscopia a fluorescenza a campo luminoso e confocale.
Utilizzando un ugello a punta di 30 micrometri, è possibile stampare stabilmente su piastre di Petri più tipi di bio-inchiostro, tra cui PBS, alginato all'1,5% e gelatina all'1,5%. Man mano che gli inchiostri aumentano di viscosità, il processo di stampa diventa sempre più difficile e sono necessarie maggiori forze motrici per ottenere goccioline più grandi. I parametri di stampa possono essere impostati per stampare le goccioline in specifiche disposizioni 2D, come osservato in questo esperimento di stampa.
Il diametro della punta dell'ugello ha un impatto diretto delle dimensioni del microvettore che può essere stampato. Come osservato in queste immagini a campo luminoso e confocali, le cellule A549 aderiscono ai microcarrier alginato-collagene dopo due giorni di coltura. Dopo sei giorni, le celle dell'A549 coprono quasi completamente le superfici del microvettore.
Seguendo questa procedura, abbiamo rivestito la superficie del microvettore con chitosano e utilizzato gluconato per sciogliere il gel di alginato per formare una struttura cistica che può essere applicata per costruire strutture cave come gli alveoli. Il processo di stampa per la preparazione di microcarrier è abbastanza delicato, quindi questo metodo può essere ampiamente utilizzato per la stampa di microcarrier contenenti cellule.
