L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure coinvolte nell'esecuzione di una schiacciamento del nervo sciatico irriproducibile e fornire un protocollo per la valutazione del comportamento motorio dopo un trauma periferico. La selezione di una batteria di test comportamentale potente e affidabile è essenziale per coprire una vasta gamma di aspetti comportamentali e dipende dal modello animale utilizzato e dalla domanda di ricerca scientifica. Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e fornisce una batteria di prova comportamentale per la valutazione dei deficit motori nei ratti, che include il test sul campo aperto, l'analisi dell'andatura CatWalk, il compito di camminata del fascio e il compito di camminare con gradini a scala.
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Mantenere un ambiente sterile durante l'intera procedura chirurgica. Impostare il tavolo dell'intervento chirurgico con l'attrezzatura necessaria.
Anestetizza profondamente il topo in un armadio chiuso con isoflurane e rade una vasta area dell'arto posteriore destro. Quindi, posizionare il ratto nella maschera di anestesia e continuare l'anestesia profonda con isoflurane. Fissare il busto e entrambi gli arti posteriori del topo con del nastro adesivo.
Posizionare entrambi gli arti posteriori in una posizione simmetrica e tesa e ruotare ogni zampa piatta sul tavolo dell'intervento chirurgico. Disinfettare la pelle dell'area rasata con un antisettico appropriato. Cerca la tacca sciatica dell'ileo.
Fai un'incisione cutanea dalla tacca sciatica nella direzione della zampa con un bisturi. Se gli arti posteriori sono fissi e l'incisione cutanea viene eseguita correttamente, si può vedere una cavità nel piano fasciale tra il muscolo gluteo massimo e il muscolo bicipite femoris che assomiglia a una linea bianca. Inserire le forcep emostatiche super fini chiuse nella cavità e stendere le forcep.
Il piano fasciale dovrebbe aprirsi senza ferire alcun tessuto muscolare. Posizionare i retrattini dell'elastico sotto i muscoli per mantenere aperta l'incisione cutanea. Rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto e vasi sanguigni circostanti dal nervo sciatico fino a quando il nervo non è completamente esposto.
È importante non allungare o tirare il nervo durante l'intera procedura. Schiacciare il nervo sciatico con un morsetto non seghettato con pressione utilizzabile costante e rapida. Per questo, aprire il morsetto, posizionare il nervo sulla mascella inferiore del morsetto e chiudere il morsetto bloccandolo nella prima posizione per 3 x 10 secondi.
Dopo la lesione da schiacciamento, riaprire attentamente il morsetto. il sito di schiacciamento del nervo sciatico appare traslucido. Rimuovere i retrattiri dell'elastico.
Chiudere l'incisione del piano fasciale con una sutura riassorbibile. Chiudere l'incisione cutanea con le graffette della pelle del corpo. L'attività locomotoria, così come l'attività comportamentale dei ratti possono essere analizzate da un test a campo aperto.
La configurazione del campo aperto, che dovrebbe essere posizionata in un ambiente buio e silenzioso, è costituita dal sistema di tracciamento video automatizzato, EthoVision XT, e da un'arena con una superficie nera pulita e resistente ai graffi. Posizionare l'arena e la fotocamera nella posizione corretta e configurare il software EthoVision XT. Posizionare delicatamente il topo nel mezzo dell'arena di prova.
Durante la registrazione, lo sperimentatore dovrebbe stare lontano dal campo aperto impostato, al fine di evitare di distrarre il topo. Per l'analisi dei dati del test a campo aperto, passare alla sezione analisi nella barra laterale sinistra e scegliere Visualizzazione traccia"sotto la scheda Risultati". Quindi, esportare i parametri necessari in XL.All'interno del software, scegliere una serie di variabili di diverse categorie per l'analisi dei dati.
Un'analisi dell'andatura da parte del sistema CatWalk XT può aiutare a valutare molti parametri diversi riguardanti le impronte, la posizione e l'andatura dei modelli animali. Una passerella di vetro è illuminata con luce verde e la luce diffusa dalle impronte degli animali viene catturata con una videocamera ad alta velocità, che si trova sotto la passerella. I segnali possono essere analizzati con il software CatWalk XT.
L'esperimento deve essere eseguito in condizioni di buio. Inizia impostando il sistema CatWalk XT. Scegliere le impostazioni sperimentali.
Posizionare la fotocamera in posizione e regolare la messa a fuoco. Impostare le impostazioni di rilevamento. Impostare le pareti del corridoio del sistema CatWalk e assicurarsi che le pareti rimangano parallele alla passerella.
Definire la lunghezza della passerella e calibrare la passerella. Quindi, ancora un'immagine di sfondo. Per l'immagine di sfondo è necessaria una passerella pulita e vuota.
Il topo dovrebbe attraversare la passerella senza alcuna interruzione. Secondo i criteri di esecuzione definiti, sono necessarie tre esecuzioni conformi per ratto per l'analisi dei dati. Addestrare gli animali per almeno otto giorni prima di iniziare con l'esperimento vero e proprio.
La passerella deve essere eseguita almeno una volta alla settimana, con da 6 a 10 esecuzioni per garantire prestazioni di attività continue. Per l'analisi dei dati, valutare solo le esecuzioni conformi. Classificare automaticamente le impronte dei pegni con il software CatWalk XT.
Rivedere manualmente le etichette di stampa della zampa. Correggere le etichette di stampa errate delle zampe, aggiungere etichette di impronte di zampe non rilevate ed eliminare qualsiasi rumore ed etichetta errata. I risultati numerici visualizzati in un foglio XL, che mostrano una serie di parametri di base.
Per informazioni più dettagliate su ogni impronta, classificare le dita dei piedi delle zampe posteriori. Questa analisi richiede il modulo di misurazione interattiva dell'impronta. Impostare manualmente i marcatori per l'analisi dell'impronta.
Analizza ogni stampa della zampa posteriore in tutte e tre le corse conformi. Disegnare una linea dal centro del primo dito del giorno per misurare la diffusione. Disegnare una linea dal centro del secondo dito del dito del secondo al centro del quarto dito del dito per misurare lo spread intermedio delle dita dei dita dei dita dei dati.
Disegnare una linea dal centro del terzo dito del piede al tallone della zampa posteriore per misurare la lunghezza di stampa manuale. Esaminare i risultati numerici delle misurazioni interattive dell'impronta visualizzate in un foglio separato. I deficit di andatura possono essere determinati dal compito di camminare con il raggio.
Il compito di beam walking in questo specifico argomento di ricerca sarà l'analisi della coordinazione motoria e non la valutazione dell'equilibrio motorio. Per il compito di camminare con il fascio, sono necessari un fascio, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera. Usa un fascio di legno di 90 centimetri di lunghezza, 1,7 centimetri di larghezza e 2 centimetri di altezza.
Addestrare gli animali per sette giorni. Posizionare il topo sulla piattaforma iniziale della trave. Il topo dovrebbe attraversare la trave tre volte senza alcuna interruzione.
Anche se il ratto raggiunge tre corse conformi entro le prime tre esecuzioni, è necessario effettuare almeno 6-10 esecuzioni per prestazioni continue delle attività. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione. Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate.
Qui, il punto di ora di inizio è etichettato da una linea nera sulla trave, e il posizionamento del primo arto posteriore dietro la linea nera è definito come il punto di inizio della corsa. Il posizionamento del primo arto posteriore sulla piattaforma alla fine della trave definisce il punto di fine del tempo. Quindi, calcola il tempo necessario affinché il topo attraversi il fascio.
Ottieni il numero di passaggi ed errori da tre esecuzioni conformi per entrambi gli arti posteriori separatamente, utilizzando la funzione zoom e slow motion del software. Gli errori includono scivolamenti totali del piede e scivolamenti di mezzo piede. Uno slittamento totale del piede è definito come un posizionamento del piede seguito da uno slittamento profondo, causando una perdita di contatto della zampa interessata con la trave.
Un mezzo scivolo è definito come la zampa che scivola dalla parete laterale della trave senza perdere il contatto completo. Calcolare la percentuale di scivolamenti del piede in relazione al numero di passaggi per attraversare la trave. Il compito di camminare in scala può valutare la funzione motoria, il posizionamento sia degli arti anteriori che degli arti posteriori e la coordinazione tra gli arti.
Per questo test comportamentale sono necessari un apparato a pioli, un distanziale, un tavolo, uno sfondo uniforme e una videocamera. L'apparato orizzontale a gradini a lettere è costituito da gradini metallici e pareti laterali in policarbonato chiaro. Addestrare gli animali per otto giorni.
Posizionare il topo nella zona iniziale degli operatori del gradino della scala. Il topo deve attraversare la passerella di 100 centimetri dell'apparato a pioli tre volte senza interruzione, per qualificarsi come una corsa conforme. Selezionare le sequenze video di tre esecuzioni conformi dalla registrazione.
Definire il punto di ora di inizio e il punto di fine delle tre esecuzioni conformi selezionate. Il posizionamento dell'arto posteriore dietro la prima linea nera sulla parete laterale dell'apparato definisce il punto di inizio della corsa. Il posizionamento del primo arto anteriore dietro la seconda linea nera sulla parete laterale dell'apparato definisce il punto di fine della corsa.
Quindi, calcola la durata della corsa attraverso la passerella. Ottieni il punteggio delle tre esecuzioni conformi con la scala delle 7 categorie di Mets e colleghi utilizzando il rallentatore o la funzione frame-by-frame del software. Determinare separatamente il numero di passaggi e il numero di errori in base alle categorie della scala per ogni arto.
La scala distingue tra le seguenti categorie. Totale mancanza. Scivolo profondo.
Leggero scivolone. Replacement.Correction. Posizionamento parziale. E il posizionamento corretto.
Quindi, calcolare gli errori per passaggio. I risultati rappresentativi del test a campo aperto di cinque minuti mostrano che la lesione da schiacciamento nervoso, cinque settimane dopo l'intervento chirurgico, non ha alcun effetto sull'attività locomotoria. L'analisi dell'andatura con il sistema CatWalk XT genera molti parametri diversi.
Potrebbero essere rilevate alterazioni significative per la velocità media di corsa, la lunghezza del passo e l'area di stampa della zampa posteriore destra ferita dal nervo. I ratti selvatici feriti dai nervi hanno mostrato un tempo di latenza significativamente aumentato per attraversare il fascio, rispetto ai ratti ingenui di tipo selvaggio cinque settimane dopo la lesione. Come ulteriore lettura del compito di camminare con il fascio, sono stati conteggiati e considerati come un errore per l'analisi statistica gli scivolamenti completi e i semiscivolti dell'arto posteriore ferito dal nervo.
La percentuale di errori per passo dell'arto posteriore destro ferito dal nervo è stata significativamente aumentata nei ratti di tipo selvatico feriti dai nervi, rispetto ai ratti ingenui di tipo selvatico. I dati rappresentativi del compito di camminata a gradini della scala non mostrano alterazioni significative nel tempo di latenza per attraversare la passerella dell'apparato a pioli o nella percentuale di errori per passo dell'arto posteriore destro ferito dal nervo. L'analisi della percentuale di errore per passo dell'arto posteriore nevralgico ha considerato solo il punteggio da 0 a 2 della scala delle 7 categorie da Mets e colleghi.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo sciatico e come implementare una valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la schiacciamento unilaterale del nervo sciatico. Per ottenere risultati coerenti, riproducibili e comparabili dopo una lesione da schiacciamento del nervo sciatico, è essenziale un metodo standardizzato per indurre la schiacciata nervosa, nonché una caratterizzazione fenotipica standardizzata. Una formazione adeguata per un test di comportamento specifico offre i vantaggi di risparmiare tempo durante la valutazione dell'esperimento e ottenere risultati migliori.
