L'attuale protocollo contribuisce allo studio dei meccanismi cerebrali alla base del comportamento motorio qualificato. L'optogenetica wireless consente la manipolazione di neuroni specifici mentre i soggetti svolgono un compito in libera circolazione. In combinazione con la videografia ad alta velocità, è possibile avere un'analisi dettagliata del comportamento motorio fine.
Il metodo potrebbe aiutare a comprendere i problemi motori nei disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare la funzione cerebrale anche in altri paradigmi comportamentali. Diana Rodriguez-Munoz, una studentessa universitaria del mio laboratorio, assisterà con l'esperimento.
Per le procedure chirurgiche, iniziare preparando una cannula LED della lunghezza desiderata secondo le coordinate dorso-ventrali della struttura di interesse. Per fare ciò, tagliare la fibra di vetro a una lunghezza superiore alla dimensione finale desiderata e macinare la punta della fibra alla lunghezza target con carta vetrata ruvida. Quindi, lucidare la punta della fibra con carta vetrata fine.
Per le microiniezioni, riempire una pipetta con l'olio minerale e posizionare la pipetta nel microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore funzioni correttamente iniettando un po 'di olio minerale. Quindi, preparare il topo anestetizzato per l'intervento chirurgico applicando un unguento oftalmico e rimuovendo i peli dal cuoio capelluto con un trimmer e una crema per la depilazione.
Quindi, pulire il cuoio capelluto con tamponi di cotone con 8% di iodio povidone e 70% di etanolo alternati tre volte ciascuno. Dopo la sanificazione, posizionare il mouse nell'apparato stereotassico e fissare la testa, assicurandosi che il cranio sia livellato negli assi mediale-laterale e anteriore-posteriore. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione di un centimetro attraverso il cuoio capelluto a livello degli occhi lungo l'asse sagittale.
Quindi, ritrarre la pelle per esporre il cranio e pulire il periostio con tamponi di cotone. Pulire la superficie del cranio con soluzione salina e tamponi di cotone e risolvere eventuali emorragie in superficie utilizzando lance oculari assorbenti sterili. Quindi, applicare una goccia di perossido di idrogeno al 2,5% con un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per alcuni secondi per rendere visibili le suture del cranio e avere un riferimento migliore.
Dopo alcuni secondi, pulire accuratamente l'area con un batuffolo di cotone pulito. Con una pipetta di vetro del diametro finale della punta di 15 micron, individuare bregma e lambda per verificare che il cranio sia livellato nell'asse anteriore-posteriore. Quindi, dipingere un punto di riferimento nel cuoio capelluto sopra le coordinate selezionate con un pennarello.
Nel punto di riferimento, eseguire una craniotomia di un millimetro di diametro applicando una leggera pressione al cranio con uno strumento rotante a velocità medio-bassa con una piccola punta da trapano dentale rotonda. Una volta fatto, spostare il capillare verso le coordinate anteriore-posteriore, o AP, e mediale-laterale, o ML, selezionate. Caricare il capillare con 300-400 nanolitri del virus adeno-associato CreE-dipendente, o AAV, come AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry per esprimere channelrhodopsin nella regione di interesse.
Un AAV può essere utilizzato come controllo per esprimere la proteina reporter. Dopo essersi assicurati che la punta non sia intasata, introdurre la pipetta di vetro nel cervello alle coordinate dorso-ventrali meno 3,35 millimetri nello striato dorsale-laterale e iniettare 200 nanolitri del virus utilizzando un iniettore automatico ad una velocità di 23 nanolitri al secondo. Attendere 10 minuti dopo l'iniezione prima di ritirare lentamente la pipetta di vetro per evitare fuoriuscite.
Quindi, pulire e asciugare eventuali residui con tamponi di cotone. Quindi, collegare la cannula LED di vetro al braccio stereotassico e calibrare le coordinate utilizzando bregma come riferimento. Quindi, inserire lentamente la cannula per evitare danni ai tessuti e posizionarla a 100 micrometri sopra il sito di iniezione.
Una volta che la cannula LED è in posizione, aggiungere una goccia di 100 microlitri di adesivo tissutale sul bordo della craniotomia. Utilizzare un pennello sterile per applicare una miscela di cemento dentale appena preparata attorno al connettore della cannula a poco a poco, costruendo strati fino a quando il cranio è coperto e il connettore è fissato saldamente al cranio, lasciando i perni completamente liberi. Quando il cemento si asciuga completamente, chiudere la pelle intorno all'impianto usando l'adesivo tissutale.
Quindi, posizionare il mouse in una gabbia di recupero su una piastra riscaldante a 33 gradi Celsius durante il monitoraggio dei segni di disagio o dolore. Registra il comportamento dell'animale con una normale fotocamera e cattura da 30 a 60 fotogrammi al secondo dalla parte anteriore della camera. Uno specchio può essere posizionato sotto la camera di allenamento con un angolo di 45 gradi per monitorare la postura dell'animale.
Quando i topi iniziano a raggiungere il pellet, ruotare manualmente la cannula LED con il telecomando per avere una stimolazione continua per il tempo in cui il comportamento viene eseguito per non più di due secondi. Il dispositivo di stimolazione attiva un LED di 470 nanometri con intensità alla punta di un milliwatt per millimetro quadrato. Il comportamento motorio fine dell'animale sotto manipolazioni optogenetiche è stato studiato con il compito di raggiungere la presa.
I topi hanno imparato a eseguire il compito in un paio di giorni e hanno raggiunto una precisione superiore al 55%, raggiungendo un plateau dopo cinque giorni di allenamento. La traiettoria dei movimenti è stata tracciata con la videografia ad alta velocità, rendendo possibile l'analisi della cinematica. È stata eseguita la valutazione quantificabile di parametri come distanza percorsa, velocità, accelerazione, endpoint e traiettoria.
Nelle prove mancate, i topi hanno iniziato il movimento di presa più lontano dal pellet rispetto alle prove colpite. Inoltre, gli errori sono stati significativamente associati alla postura del mouse, mostrati dalle differenze nell'angolo del corpo durante le prove colpite e mancate. L'attivazione controlaterale della dopamina D1 che esprime i neuroni di proiezione spinosa, o SPN, ha ridotto il successo di presa rispetto alle condizioni di controllo.
Durante una stimolazione optogenetica, la traiettoria della zampa aumentava nella distanza di viaggio, portando all'incapacità di colpire il pellet e ad un aumento del tipo di errore iniziale uno. L'analisi dei componenti principali, o PCA, ha mostrato che tutte le traiettorie di prova durante l'attivazione degli SPN D1 controlaterali si sono separate in un cluster con quasi nessuna sovrapposizione con il cluster di controllo, indicando una bassa somiglianza. L'attivazione dei DSPN sul lato ipsilaterale ha portato ad un aumento della dispersione della traiettoria mostrata dall'analisi PCA.
Quindi, l'attivazione ipsilaterale degli SPN D1 ha modificato la traiettoria di raggiungimento senza modificare il risultato comportamentale. Quando si esegue questo protocollo, fare attenzione a posizionare correttamente la cannula in modo che non si stacchi durante le sessioni di allenamento. Questo metodo può essere utilizzato in altri paradigmi comportamentali per studiare il comportamento motorio, l'elaborazione sensoriale, l'apprendimento e la memoria.
L'optogenetica wireless permetterà di studiare il comportamento naturalistico e le sue basi neurobiologiche in soggetti veramente liberi.
