Il nostro protocollo fornisce una nuova metodologia per creare lesioni cerebrali traumatiche nei ratti utilizzando l'irradiazione laser per creare un impatto di messa a fuoco nella corteccia motoria. Il vantaggio principale di questa tecnica sono la bassa variabilità nell'area infaribile, i bassi tassi di mortalità e la relativa semplicità della procedura che non richiede gestori esperti. A dimostrare la procedura sarà Dmitry Natanel, ricercatore del nostro laboratorio.
Per eseguire una lesione cerebrale indotta dal laser, assegna prima ratti Sprague Dawley da 20,300 a 350 grammi nel gruppo laser e 20 al gruppo di controllo gestito da Sham. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso di astinenza, posizionare un topo su un riscaldatore regolato per la temperatura rettale e utilizzare un rasoio per rimuovere abbastanza capelli dal sito della lesione con un margine privo di capelli di circa due centimetri intorno all'incisione. Disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo e posizionare il ratto in posizione prona in un portacapo stereotassico.
Fai un'incisione di tre centimetri per consentire il riflesso laterale del cuoio capelluto per esporre l'area tra bregma e lambda. Tenendo un laser Nd:YAG con lunghezza d'onda di picco di 1064 nanometri a una distanza di due millimetri dal cranio, somministrare 50 joule per 10 punti con una durata dell'impulso di un secondo all'area esposta del cranio sopra l'emisfero destro. Dopo che la lesione laser è stata consegnata, rimuovere il topo dal dispositivo e chiudere il cuoio capelluto con 3-0 suture chirurgiche di seta.
Quindi, posizionare il topo nella sua gabbia con il monitoraggio fino alla piena rimo clemenza. 24 ore dopo la procedura, utilizzare un sistema di punteggio di 43 punti per valutare il punteggio di gravità neurologica. Testare gli animali alla ricerca di deficit neurologici, disturbi comportamentali, attività di bilanciamento del fascio e riflessi e assegnare punteggi più alti per disabilità più gravi.
Dopo la valutazione, raccogliere il cervello da ogni animale sperimentale e controllare l'animale secondo protocolli standard. Per valutare il volume dell'infarto cerebrale, sezionare il cervello raccolto in sei fette coronali spesse sei millimetri e incubare ogni fetta in 0,05%TTC per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la colorazione, scansiona queste fette con uno scanner ottico con una risoluzione di 1600 x 1600 punti per pollice.
Le aree non macchiate delle fette cerebrali fisse sono definite infasate. Per valutare l'incidenza della rottura della barriera epatica, 24 ore dopo la lesione indotta dal laser caricare una siringa con colorante blu 2%Evans diluito in quattro millilitri per chilogrammo di soluzione salina e consegnare la soluzione per via endovenosa ai ratti feriti e controllare i ratti attraverso la vena della coda cannulata. Lasciare circolare la soluzione per un'ora prima di utilizzare pincet chirurgici e forbici per aprire il petto del primo animale.
Perfondere il cuore esposto con una salina raffreddata dello 0,9% attraverso il ventricolo sinistro a 110 millimetri di mercurio di pressione fino a quando non si osserva un liquido di profusione incolore dall'atrio destro. Quindi, raccogliere il cervello e ottenere due fette caudali rostrali millimetri. Separare le fette cerebrali sinistra dalle fette cerebrali destra per consentire la valutazione separata degli emisferi feriti e non feriti e pesare i campioni.
Omogeneizzare i campioni utilizzando una malta e un pestello e incubare i campioni di tessuto nel 50% di acido tricloroacetico per 24 ore. Il giorno dopo, centrifuga i campioni omogeneizzati di tessuto cerebrale per 20 minuti a 10.000 volte G e temperatura ambiente e mescola un millilitro del supernatante con 1,5 millilitri di 96% di etanolo a uno o tre rapporti. Quindi, usa un rivelatore di fluorescenza a un'eccitazione di 620 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione di 680 nanometri per valutare la rottura della barriera epatica.
Come osservato dall'analisi istologica, la colorazione blu evans può essere utilizzata per rivelare l'incidenza di lesioni cerebrali negli animali modello laser e MCAO. In questa analisi rappresentativa non sono stati registrati decessi o emorragie subaracnoidi nei gruppi di controllo o sperimentali, e il gruppo MCAO aveva un tasso del 20% sia di mortalità che di emorragia subaracnoidea. Anche le variazioni relative della temperatura corporea nei ratti di entrambi i gruppi erano simili, nonostante una differenza nella variabilità di entrambi i gruppi.
I punteggi di gravità neurologica erano significativamente peggiori sia nei modelli laser che MCAO rispetto al gruppo di controllo gestito da Sham. La lesione cerebrale indotta dal laser causò anche un significativo aumento del volume infarto nell'emisfero bersaglio rispetto al gruppo di controllo gestito da Sham. Tuttavia, il volume infarto del modello laser era inferiore rispetto agli animali feriti dalla tecnica MCAO.
Non è stata osservata alcuna differenza nell'edema cerebrale tra il modello di lesione cerebrale indotta dal laser e il gruppo di controllo gestito da Sham. Tuttavia, c'era una differenza significativa nell'edema cerebrale tra il modello laser e i gruppi feriti MCAO. Rispetto al gruppo di controllo gestito da Sham, la lesione cerebrale indotta dal laser e le tecniche MCAO hanno entrambi causato un aumento significativo della rottura della barriera epatica nell'emisfero non ferito e bersaglio.
Durante il tentativo di questo modello, ricordarsi di indirizzare con precisione l'area della corteccia motoria e di standardizzare l'energia, il numero di punti irradiati e il tempo totale di esposizione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un'ampia pletora di test comportamentali, come beam walking, Froedert e altre valutazioni.
