Questo protocollo ha permesso di rispondere a una domanda importante nel campo delle metastasi tumorali. Compreso, come le cellule tumorali colonizzano il polmone? In che modo le cellule tumorali rimangono dormienti?
E cosa li induce a uscire dalla dormienza e alla fine a formare metastasi. Il vantaggio principale di questo protocollo è che il processo metastatico dinamico può essere studiato direttamente in vivo, in tempo reale, in un microambiente reale. Questo metodo può fornire informazioni su diverse malattie polmonari, ma è particolarmente utile per comprendere il comportamento delle singole cellule tumorali che si diffondono al polmone, un sito comune di metastasi.
Per iniziare usa una sutura di seta 2-0 per legare un nodo alla base di un catetere calibro 22, lasciando code lunghe 2 pollici. Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, spostare il mouse sul tavolo operatorio, intubare il mouse e quindi fissare il catetere di intubazione legando la sutura di seta 2-0 attorno al muso del mouse. Collegare il ventilatore al catetere di intubazione.
Usando del nastro di carta, fissare gli arti anteriori cranicamente e posteriori caudalmente alla fase chirurgica riscaldata. Posizionare un nastro di carta lungo la lunghezza della schiena del mouse per massimizzare l'esposizione al campo chirurgico. Sollevare la pelle con la pinza ed effettuare un'incisione circolare di circa 10 mm a circa 7 mm a sinistra dello sterno e circa 7 mm superiore al margine subcostale.
Asportare i tessuti molli sovrastanti le costole. Elevare la sesta e la settima costola usando una pinza. Utilizzare una singola lama delle forbici smussate microssanti con il lato arrotondato verso il polmone per perforare con cura il muscolo intercostale tra la sesta e la settima costola per entrare nello spazio intratoracico.
Scaricato delicatamente il contenitore di aria compressa al difetto per far collassare il polmone e separare il polmone dalla parete toracica. Sparare l'aria compressa in brevi raffiche per prevenire lesioni polmonari iatrogene. Posizionare il punzone della biopsia sopra l'utensile da taglio e manovrare attentamente la base dell'utensile da taglio attraverso l'incisione intercostale.
Orientare la base dell'utensile da taglio parallelamente alla parete toracica e praticare un foro circolare di 5 mm attraverso la gabbia toracica. Utilizzando una sutura di seta 5-O, posizionare un punto di corda della borsa, a circa 1 mm dal foro, circonferenzialmente. Quindi, posizionare il telaio della finestra nella parete toracica con i bordi del difetto circolare catturato all'interno della scanalatura delle finestre.
Legare saldamente la sutura di seta 5-O per bloccare saldamente la finestra impiantata. Applicare un flusso costante e delicato di aria compressa per circa 10-20 secondi per asciugare il polmone. Utilizzare la pinza per afferrare il telaio della finestra dal suo bordo esterno e sollevare delicatamente per garantire la separazione del polmone dal sottosuolo del telaio della finestra.
Erogare un sottile strato di adesivo cianoacrilato lungo la superficie inferiore del telaio della finestra ottica. Premere delicatamente ma con fermezza il telaio della finestra ottica sul tessuto polmonare per 10-20 secondi per il fissaggio. Erogare una goccia di adesivo di 5 mm su una slitta rettangolare.
Utilizzare lo strumento di prelievo a vuoto per raccogliere uno slittamento di copertura di 5 mm. Immergere il sottosuolo del coperchio scivolare nell'adesivo, quindi raschiare via l'adesivo in eccesso tre volte contro il lato del coperchio rettangolare scivolare per fare uno strato molto sottile di adesivo sul coperchio slip. Posizionare con attenzione lo slittamento del coperchio ad angolo all'interno della rientranza al centro del telaio della finestra ottica, appena sopra il tessuto polmonare.
Bloccare brevemente il ventilatore per generare una pressione positiva, ipergonfiando il polmone. Orientare lo slittamento del coperchio parallelamente al tessuto polmonare, utilizzando il movimento rotatorio per creare una deposizione diretta tra la superficie polmonare e il sottosuolo dello slittamento del coperchio. Mantenere una pressione delicata per circa 25 secondi per impostare l'adesivo cianoacrilato.
Separare lo slittamento del coperchio dallo strumento di prelievo del vuoto con una pinza. Creare un punto a corda di borsa, circonferenzialmente, a meno di 1 mm dal bordo tagliato dell'incisione cutanea utilizzando la sutura di seta 5-O. Infilare la pelle in eccesso sotto il bordo esterno del telaio della finestra prima di legare saldamente la finestra con nodi di bloccaggio.
Erogare una piccola quantità di adesivo all'interfaccia in vetro metallico per garantire una tenuta ermetica tra lo slittamento del coperchio e il telaio della finestra. Attaccare l'ago sterile a una siringa da insulina da 1 ml. Inserire l'ago sotto il processo xifoideo, avanzando verso la spalla sinistra, entrando nella cavità toracica attraverso il diaframma.
Estrarre delicatamente la siringa per rimuovere l'aria residua dalla cavità toracica. L'imaging intravitale multifotonico di una singola regione polmonare ha mostrato che il microvascolare potrebbe essere spostato per tre giorni consecutivi. Il punto di diramazione definibile da una singola nave è stato identificato ogni giorno consecutivo.
Gli eritrociti non etichettati creavano ombre quando fluivano in vasi più grandi. L'angolo dei punti di diramazione rispetto alla nave può essere utilizzato per calcolare le portate degli eritrociti. La velocità degli eritrociti è stata anche quantificata iniettando il topo con microsfere fluorescenti e le loro lunghezze di traccia sono state misurate divise per il tempo di acquisizione del fotogramma.
Le microsfere stazionarie e fluenti erano distinguibili. Il destino delle cellule tumorali disseminate è stato monitorato con l'imaging seriale per diversi giorni, utilizzando la finestra per l'imaging ad alta risoluzione del polmone. La cellula tumorale è arrivata e si è depositata nella vascolarizzazione polmonare il primo giorno.
Tuttavia, la cellula non è stata rilevata nella vascolarizzazione polmonare il secondo e il terzo giorno, indicando ricircolo o stravaso. Le fasi culminanti della progressione metastatica nel polmone sono state visualizzate a partire dall'arrivo delle cellule tumorali, dallo stravaso delle cellule tumorali nel parenchima polmonare e dalla proliferazione per formare macro metastasi. Fare attenzione ad evitare traumi al polmone durante il posizionamento del telaio ottico della finestra.
Il polmone è soggetto a sanguinamento, che in seguito impedirà l'aderenza allo scivolamento della copertura durante il posizionamento. Altri metodi che possono essere eseguiti seguendo questa procedura includono la microscopia intravitale, che se impiegata con un approccio modificato alla microcartografia, consente una precisa rilocalizzazione delle aree di interesse per l'imaging ripetuto. Questo protocollo ha permesso la visualizzazione del polmone nell'indagine di una domanda chiave sul meccanismo delle metastasi.
Questo studio ha il potenziale per ricostruire un nuovo trattamento per i malati di cancro.
