Più del 50% dei pazienti affetti da cancro del colon-retto sviluppa metastasi epatiche attraverso la disseminazione della vena porta. E gli attuali modelli animali per studiare le metastasi epatiche del cancro del colon-retto rimangono inadeguati a ricapitolare il processo biologico. L'iniezione di vena porta di tumoroidi del cancro del colon-retto fornisce un ambiente tumorale ricco di fibroblasti che consente lo studio del crosstalk tra cellule tumorali metastatiche e CAS nelle metastasi epatiche del cancro del colon-retto.
Questa tecnica fornisce una piattaforma per valutare l'efficacia delle strategie terapeutiche mirate al microambiente tumorale delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto. Questo metodo è particolarmente utile per studiare le interazioni tra CAS, cellule tumorali e microambiente tumorale. Se la punta di cotone non viene posizionata correttamente sul sito di iniezione, può verificarsi un sanguinamento eccessivo dopo la rimozione dell'ago.
L'ammollo della punta di cotone si interrompe una volta individuato il sito di iniezione. Identificare la vena porta e visualizzare il sito di iniezione può essere difficile senza la dimostrazione visiva di questa procedura. Per iniziare, preparare un'area chirurgica asettica usando tende sterili su una piastra riscaldante.
Inoltre, preparare tutti gli strumenti necessari per la chirurgia come descritto nel manoscritto di testo. Quindi illuminare l'area chirurgica regolando la posizione della sorgente luminosa. Successivamente, iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di buprenorfina in un topo per la gestione chirurgica del dolore.
Quindi anestetizzare il mouse e utilizzando un rasoio elettrico, radere il centro alla parte superiore dell'addome in un'area distante dall'area chirurgica asettica per evitare che i capelli contaminino il sito. Pulire il sito di incisione alternando betadine ed etanolo all'80% per sterilizzare l'area chirurgica. Ripeti tre volte.
Posizionare il mouse nell'area chirurgica su una piastra riscaldante in posizione supina con mantenimento dell'anestesia isoflurano. Quindi posizionare un drappo chirurgico con un foro sull'addome. Sollevare la pelle addominale con una pinza e fare un'incisione cutanea di due o tre centimetri sulla linea mediana con le forbici, tagliando solo la pelle, assicurandosi che l'incisione vada dal medio addome al processo xifoide dello sterno e non sopra l'estremità inferiore del processo xifoide.
Quindi sollevare completamente la parete peritoneale con una pinza e fare un'incisione simile di due o tre centimetri al peritoneo con le forbici. Evitare di tagliare l'intestino e il diaframma. Quindi, immergere una garza chirurgica con soluzione salina calda e posizionarla accanto all'incisione sulla destra del chirurgo.
Estrarre delicatamente l'intestino tenue e crasso usando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina e posizionarli sulla garza imbevuta di soluzione salina. Coprire l'intestino con un'ulteriore garza bagnata per mantenerli umidi. Quindi, tirare delicatamente l'intestino alla destra del chirurgo con la garza bagnata.
Quindi applicare una leggera tensione per visualizzare la vena porta. Se la visualizzazione della vena porta è difficile, regolare delicatamente la posizione dello stomaco con un batuffolo di cotone bagnato. Dopo aver convogliato delicatamente la sospensione tumoroide più volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea, aspirare 100 microlitri della sospensione cellulare in una siringa Hamilton o da un millilitro attaccata a un ago calibro 33, evitando bolle d'aria.
Inserire lentamente la smussatura dell'ago nella vena porta con una profondità di inserimento di tre o quattro millimetri e l'angolo dell'ago quasi parallelo alla vena porta. Iniettare le cellule tumorali lentamente per oltre 30 secondi per prevenire l'occlusione della vena porta. Il colore del fegato cambia temporaneamente da rosso a bianco.
Dopo l'iniezione, rimuovere lentamente l'ago e applicare immediatamente una leggera pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto per cinque minuti. Rimuovere il batuffolo di cotone e applicare immediatamente una spugna emostatica sul sito di iniezione. Tenere la spugna con un batuffolo di cotone o una pinza e applicare una leggera pressione per altri cinque minuti.
Dopo cinque minuti, rimuovere la pressione sulla spugna emostatica e confermare che non vi è sanguinamento dal sito di iniezione. Se si verifica sanguinamento, eseguire immediatamente l'emostasi da pressione con un batuffolo di cotone per circa 10 minuti. Quindi applicare una spugna emostatica aggiuntiva per altri cinque minuti.
Dopo aver confermato che non c'è sanguinamento, rimuovere le garze chirurgiche sull'intestino. Quindi, utilizzando una siringa riempita con cinque millilitri di soluzione salina, spruzzare la soluzione salina all'intestino per prevenire l'adesione degli organi. Posizionare delicatamente l'intestino all'interno della cavità addominale e suturare il peritoneo utilizzando 4-0 suture di poliglactina.
Quindi sollevare entrambi i lati della pelle con una pinza, applicare le cucitrici per chiudere l'incisione cutanea, facendo attenzione a non pinzare l'intestino. Spegnere l'isoflurano, ma mantenere il flusso di ossigeno in funzione. Monitorare attentamente il mouse.
E quando il topo si sveglia, mettilo in una gabbia vuota su una piastra riscaldante. Monitorare il mouse fino a quando non è cosciente e deambulante normalmente. Quattro ore dopo l'intervento chirurgico, iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina.
Monitorare attentamente il topo ogni giorno per una settimana, controllando le suture e la guarigione delle ferite. Da sette a 10 giorni dopo l'intervento chirurgico, rimuovere le cucitrici della pelle utilizzando un dispositivo di rimozione della pinzatrice. L'ibridazione di RNA in situ due settimane dopo l'iniezione di AAV-8 Islr della vena caudale ha mostrato una sovraespressione di Islr nel fegato.
Due settimane dopo l'iniezione di AAV mRuby2, sospensioni monocellulari di organoidi del cancro del colon sono state iniettate nella vena porta del topo. Macroscopicamente, questa iniezione di vena porta ha provocato più noduli tumorali bianchi nel fegato. La colorazione di ematossilina ed eosina delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto indotte dall'iniezione della vena porta ha dimostrato istopatologia di adenocarcinoma tubulare moderatamente differenziato accompagnato da una reazione stromale desmoplastica e necrosi.
Questa istologia ricca di stroma ricapitolava fedelmente quella delle metastasi epatiche del cancro del colon-retto umano, rendendo questo modello adatto per la ricerca traslazionale che indaga lo stroma tumorale metastatico. L'immunoistochimica per l'actina alfa della muscolatura liscia ha confermato la presenza di fibroblasti associati al cancro, mentre la colorazione rossa di Picro-Sirius ha dimostrato un'abbondante matrice extracellulare nel mesenchima tumorale. L'immunochimica per EPCAM ha rivelato che il cancro colorettale metastatico ha mostrato un germogliamento tumorale, che è una caratteristica del cancro del colon-retto a prognosi sfavorevole.
E l'indice di marcatura Ki67 era di circa l'80%, indicando che la maggior parte delle cellule tumorali sono mitoticamente attive. I topi hanno mostrato una sopravvivenza mediana di 57 giorni dopo l'iniezione di tumoroidi nella vena porta. I topi trattati con AAV-8 Islr hanno mostrato una migliore sopravvivenza del topo, una diminuzione dei segnali di imaging in vivo dai tumori, una maggiore segnalazione delle proteine morfogenetiche ossee e una diminuzione delle cellule proliferanti di Ki67.
Assicurarsi che la punta di cotone venga applicata al giusto sito di iniezione e che la spugna emostatica venga applicata solo dopo che il sanguinamento si è fermato. La creazione del tumore può essere monitorata utilizzando l'imaging IVIS per assicurarsi che le cellule tumorali crescano all'interno del fegato.
