Abbiamo utilizzato il metodo della vena caudale per generare metastasi cerebrali in modelli murini utilizzando linee cellulari derivate da pazienti con carcinoma mammario infiammatorio, o IBC, una forma altamente aggressiva di carcinoma mammario primario. La generazione di metastasi cerebrali nei modelli murini comporta tipicamente iniezioni arteriose intracardiache o intracarotidi. Tuttavia, il metodo della vena caudale offre un vantaggio rispetto a queste tecniche in quanto imita meglio le fasi della colonizzazione delle metastasi cerebrali ed è relativamente semplice da eseguire.
I dottori Xiaoding Hu ed Emilly Villodre, entrambi istruttori nel mio laboratorio, dimostreranno la procedura. Per rilevare le metastasi cerebrali mediante imaging GFP da otto a 10 settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali, disinfettare il topo con etanolo al 70% e rimuovere la pelliccia dalla testa e dalle orecchie. Taglia l'area cervicale del collo.
Eliminare e rimuovere il cranio per consentire al cervello di essere raccolto. Metti il cervello in una cassetta di tessuto e metti la cassetta in un contenitore di DPBS freddo per non più di un'ora. Per l'imaging mediante stereomicroscopia, trasferire il cervello in un coperchio di tessuto di 100 centimetri sotto un microscopio stereo dotato di luce UV e selezionare l'obiettivo 0,5x per consentire la visualizzazione dell'intero cervello.
Premere live view e mettere a fuoco la vista mentre il cervello è in posizione ventrale. Selezionare il filtro appropriato nel software e nel microscopio per il marcatore fluorescente nelle celle e scattare una foto. Senza spostare il campione, passare all'imaging in campo chiaro e selezionare il filtro in campo chiaro.
Scatta una foto. Quindi immagina il cervello in posizione dorsale come dimostrato in precedenza. Per analizzare l'intera immagine del cervello, prima converti i file di immagine da TIFF a JPEG in modo che possano essere aperti con qualsiasi computer che non abbia il software associato.
Quindi, apri una coppia di immagini a campo chiaro e fluorescenti e seleziona i canali di file e unione. Selezionare i componenti appropriati, fare clic su OK e salvare l'immagine unita. Per quantificare l'area del tumore cerebrale nell'immagine fluorescente, selezionare la selezione automatica.
Spostate la freccia nell'area di posizione GFP e fate clic per creare automaticamente una selezione. Quindi fare nuovamente clic per confermare la selezione. Verranno mostrate tutte le misure.
Se è possibile osservare più di un'area positiva alla GFP, ripetere la misurazione con l'area successiva. Le lesioni metastatiche cerebrali possono essere rilevate già otto settimane dopo l'iniezione mediante imaging della luciferasi e microscopia stereo fluorescente. Dopo l'imaging, porzioni delle metastasi cerebrali possono essere fissate in formalina ed elaborate per la colorazione con ematossilina ed eosina per convalidare la presenza di lesioni da metastasi cerebrali e per la colorazione immunoistochimica per rilevare specifici marcatori proteici di interesse.
Quando si tenta questo protocollo, è importante mantenere la vitalità cellulare mantenendo le cellule sul ghiaccio per non più di un'ora ed evitare bolle d'aria nella sospensione cellulare per prevenire la formazione di emboli e la mortalità del topo. Dopo l'iniezione della vena caudale, monitoriamo le crescite e la progressione delle metastasi cerebrali con l'imaging della luciferasi. Dopo l'eutanasia, la microscopia stereofluorescente e l'istologia hanno confermato le lesioni da metastasi.
