Questo protocollo presenta informazioni sulle fioriture algali e su come monitorare efficacemente le specie algali tossiche. La procedura aiuta a fornire un allarme precoce delle fioriture algali per proteggere la comunità dai danni associati. L'analisi di metabarcoding può rilevare molte specie in un campione contemporaneamente, ma richiede procedure complicate.
Questo protocollo spiega visivamente ogni passaggio per ridurre al minimo gli errori umani durante l'analisi. Le procedure di microscopia saranno dimostrate da Henry Cameron dell'Università Antofagasta, la raccolta di campioni di Jonathan Vilugron dell'Instituto de Fomento Pesquero, il pre-trattamento del campione di Karen Vergara dell'Università di Los Lagos e l'analisi del metabarcoding di Ignacio Rilling e Marco Campos dell'Università La Frontera. Inizia raccogliendo tre litri di campione d'acqua da un punto target.
Filtrare un litro di acqua per l'analisi dell'rRNA 16S attraverso una filtrazione tandem per separare i batteri viventi liberi e quelli attaccati. Quindi, filtrare un altro litro d'acqua per l'analisi dell'rRNA 18S attraverso una singola filtrazione con una membrana da 0,2 micron. Quindi, utilizzando forbici chirurgiche sterili, tagliare la membrana filtrata a metà, avvolgere una metà con un foglio di alluminio per la conservazione e con l'altra metà procedere all'estrazione del DNA con il metodo Chelex.
Per l'analisi microscopica, trasferire un millilitro del campione d'acqua su una slitta a griglia di un millilitro utilizzando una pipetta. Osservare il campione al microscopio e registrare i nomi e la quantità delle specie di fitoplancton. Pulire le pipette nell'armadio della cappa laminare con il 70% di etanolo, seguite dall'esposizione ai raggi UV per 30 minuti.
Per la prima generazione di amplicon PCR, aliquot 22,5 microlitri della miscela master in una striscia di otto tubi seguita da 2,5 microlitri del campione di DNA, quindi eseguire il primo ciclo PCR. Quindi, preparare 100 millilitri di un gel TBE al 2% di agarosio contenente 10 microlitri di una macchia di gel di acido nucleico. Una volta che il gel è pronto, caricare una miscela contenente 1,5 microlitri di un colorante di caricamento del DNA e quattro microlitri del prodotto PCR ed eseguire l'elettroforesi a 100 volt per 30 minuti.
Quindi, visualizzare il gel sotto la luce UV e confermare la presenza di una banda di coppie di basi da 500 a 600. Gli ampliconi mancanti a volte possono essere risolti diluendo il campione a 1.000 volte con acqua. Successivamente, utilizzare un sistema di pulizia del DNA basato su perline magnetiche per pulire i primi prodotti PCR, quindi trasferire 20 microlitri di ciascun primo prodotto PCR pulito su una nuova piastra a 96 pozzetti e sigillare la piastra con un film Microseal.
Conservare la piastra a meno 20 gradi Celsius fino al passaggio successivo. Per l'indicizzazione mediante seconda PCR, dopo aver diluito tutti i primer dell'indice uno e dell'indice due a una concentrazione micromolare con acqua di grado PCR in strisce PCR a otto tubi, posizionare l'indice uno primer in una riga orizzontale e indicizzare due primer in una fila verticale. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale a 2,5 microlitri di indice un primer per ogni pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti.
Quindi, aggiungere 12,5 microlitri di una formulazione pronta per l'avvio a caldo a ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di indice due primer e 7,5 microlitri del primo prodotto PCR purificato a ciascun pozzetto. Dopo aver miscelato per pipettaggio su e giù 10 volte, coprire la piastra con un film Microseal ed eseguire il secondo ciclo PCR.
Al termine della PCR, posizionare il nastro dello schermo del DNA in un analizzatore di frammenti. Mescolare due microlitri di tampone campione in tre microlitri del secondo amplicon PCR in nuove strisce di otto tubi e inserire le strisce nell'analizzatore di frammenti per avviare l'analisi. Assicurarsi che i secondi ampliconi PCR siano circa 613 coppie di basi per i geni rRNA 16S e 18S.
Purificare i secondi prodotti PCR utilizzando un sistema di pulizia del DNA di perline magnetiche, come dimostrato in precedenza. Quindi misurare la loro concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro di quantificazione dell'acido nucleico. In una nuova piastra da 200 microlitri a 96 pozzetti, diluire ogni secondo prodotto PCR purificato con acqua PCR sterile a quattro nanomoli.
Passo successivo, il protocollo deve essere eseguito senza fermarsi. Aliquota tre microlitri di ogni secondo prodotto PCR diluito in un nuovo tubo sterile da 1,5 millilitri per creare una libreria in pool. Tenere sempre il tubo a quattro gradi Celsius.
Un giorno prima del sequenziamento, rimuovere una cartuccia di reagente preriempita pronta all'uso da meno 20 gradi Celsius e posizionarla a quattro gradi Celsius per lo scongelamento. Il giorno del sequenziamento, impostare un blocco di calore adatto per tubi di centrifuga da 1,5 millilitri a 96 gradi Celsius e posizionare il buffer di ibridazione sul ghiaccio. Quindi, diluire l'idrossido di sodio di grado molecolare con acqua e diluire una libreria di controllo pronta all'uso con tampone TE.
Mescolare 16 microlitri della libreria di campioni a quattro nanomole o raggruppati con quattro microlitri della libreria di controllo in un nuovo tubo etichettato come uno. Quindi, mescolare 10 microlitri del campione dal tubo uno con 10 microlitri di idrossido di sodio in un nuovo tubo etichettato come due. Dopo il vortice e una breve rotazione, incubare il tubo due a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi aggiungere 980 microlitri di tampone di ibridazione.
Successivamente, in un nuovo tubo etichettato come tre, mescolare 260 microlitri del campione dal tubo due con 390 microlitri di buffer di ibridazione. Dopo aver mescolato il contenuto invertendo il tubo, incubarlo a 96 gradi Celsius per due minuti, seguito da incubazione su ghiaccio per due minuti. Quindi, rimuovere la cartuccia dal frigorifero e impostare il foglio campione per il sequenziamento con ciascun indice corrispondente uno e indice due adattatori.
Dopo aver rimosso la cella di flusso dal kit MiSeq V3, pulire delicatamente la cella di flusso con acqua PCR sterile di grado molecolare. Caricare l'intero volume del tubo tre nella cartuccia. Quindi, nel software di funzionamento dello strumento, selezionare la sequenza e seguire le istruzioni per inserire la cella di flusso, il buffer di incorporazione e la cartuccia.
Infine, caricare il foglio campione e premere Esegui per avviare la reazione. Questa esecuzione della sequenza richiede da tre a cinque giorni. L'analisi di metabarcoding dell'rRNA 18S per identificare le specie algali presenti nell'acqua di mare raccolta da Metri Puerto Montt, in Cile, il 19 febbraio 2019, ha prodotto 13.750 letture, con oltre 30 specie algali.
La specie Navicula era l'algo dominante con un'abbondanza relativa del 70,73%Inoltre, è stata osservata un'abbondanza sufficiente per le specie Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella e Prorocentrum. La specie Pseudochattonella, una delle principali causate delle fioriture algali dannose cilene, ha un'abbondanza dello 0,52%. Coerentemente con l'analisi del gene rRNA 18S, l'osservazione microscopica ha mostrato Navicula come dominante e Prorocentrum come specie minore.
Il 12,6% delle piccole cellule di fitoplancton non identificabili registrate al microscopio potrebbe essere Micromonas, secondo i risultati dell'rRNA 18S. L'analisi di metabarcoding dell'rRNA 16S per identificare le specie batteriche nello stesso campione d'acqua ha mostrato 31.758 letture con oltre 30 specie batteriche. La specie batterica vivente libera dominante era Amylibacter, con un'abbondanza relativa del 20,02%, seguita da Cladella al 13,53% e Algiphilus al 7,06% L'abbondanza relativa di due specie algali tossiche, Alexandrium e Pseudochattonella, è tracciata nel tempo perché trovare un modello di crescita unico.
L'abbondanza relativa di tutti i generi batterici in ordini rilevati dall'acqua di mare nell'arco di cinque mesi viene tracciata e il tempo causato per analizzare il cambiamento di popolazione di alcuni organismi. È fondamentale essere più puliti. La contaminazione del campione deve essere evitata utilizzando una salvietta imbevuta di alcool, luce UV o autoclave del materiale.
Le soluzioni diluite non devono essere riutilizzate e i tubi devono essere sempre tappati. Il rilevamento delle alghe mediante metabarcoding deve essere abbinato alla microscopia. La specie dominante può essere confermata al microscopio garantendo l'assenza di errori umani durante i processi di metabarcoding.
Le fioriture algali dannose danneggiano l'ecosistema marino e l'economia costiera. In Cile, le fioriture algali uccidono i salmoni d'allevamento, danneggiando le aguacolture. Questa analisi di metabarcoding aumenterà l'efficienza degli avvisi di fioritura in Cile.
