Il saggio tossicologico C.elegans è prezioso. Questo protocollo descrive come trattare i C.elegans con sostanze chimiche in una piastra da 384 po ', catturare video e quantificare fenotipi correlati alla tossicologia. Questo metodo potrebbe aiutare a identificare e prevedere la potenziale tossicità acuta di una sostanza chimica.
Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di C.elegans dopo 12-24 ore di trattamento chimico in una piastra da 384 po 'con mezzo liquido. C.elegans è prezioso come buon modello di valutazione rapida della tossicità per le nuove sostanze chimiche. Come topi, può essere applicato allo screening tossico e al test di nuove sostanze chimiche, o al composto come inquinamento da agenti additivi alimentari, composto farmaceutico, composto esogeno dell'ambiente e così via.
Leggi attentamente il protocollo e segui sempre il con passo dopo passo, quindi sarai quello buono. La dimostrazione visiva è più semplice per l'utente vedere il funzionamento di ogni passaggio e il risultato dell'operazione. A dimostrare la procedura saranno Wenjing Zhang e Gaochao Han.
Sono studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, condurre un test preliminare di letalità del verme per una nuova sostanza chimica, per determinare il dosaggio più alto e il dosaggio più basso, che sono la concentrazione minima del 100% di letalità e la concentrazione massima del 100% di non letalità. Per questo esperimento, preparare sette concentrazioni di gradiente di cloruro di cadmio.
Per preparare due volte la soluzione acquosa concentrata più alta, sciogliere 92,8 milligrammi di polvere solida di cloruro di cadmio in un tubo di centrifuga riempito con otto millilitri di mezzo K. Vortice da mescolare. Dopo che la polvere è stata completamente sciolta, utilizzare una pipetta per riempire fino a 10 millilitri.
Preparare gli altri livelli di concentrazione per diluizione con mezzo K. In una panca super pulita, utilizzare una punta sterile per raccogliere una singola colonia di E.coli OP50 dalla piastra di striscia e posizionarla nel pallone con 100 millilitri di brodo LB per inoculare la colonia. Coltivalo durante la notte a 37 gradi Celsius nello shaker dell'incubatore.
Versare NGM in una piastra di Petri di plastica da 90 millilitri. Seme ogni piastra con 300 microlitri di soluzione E.coli OP50. Incubare i vermi N2 sulle piastre NGM con OP50 a 20 gradi Celsius per circa 2-3 giorni, fino a quando la maggior parte dei vermi ha raggiunto lo stadio adulto.
Con acqua sterile, lavare i vermi gravidi in un tubo di centrifuga conico sterile da 15 millilitri per raccogliere. Lascia che i vermi si sistemino per almeno 2 minuti. Aspirare l'acqua e aggiungere cinque millilitri di tampone di candeggina.
Vortice il tubo per cinque minuti, quindi mettere il tubo in una centrifuga per girare a una forza centrifuga relativa di 1300 per 30 secondi per pellettare le uova. Utilizzare una pipetta per aspirare il supernatante. Aggiungere cinque millilitri di acqua sterilizzata nel tubo per lavare le uova e vortice il tubo per cinque secondi.
Centrifugare il tubo per 30 secondi, con una forza centrifuga relativa di 1300. Rimuovere il supernatante e aggiungere cinque millilitri di acqua sterilizzata per lavare di nuovo. Pipettare le uova su un nuovo piatto NGM con OP50.
Incubarli a 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, i vermi nati raggiungono lo stadio L1. Dopo circa 40 ore, i vermi raggiungono lo stadio L4.
Con K medium, lavare i vermi stadio L4 dalle piastre di Petri in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Pipetta 50 microlitri del liquido del verme dal tubo a uno scivolo di vetro. Al microscopio stereo, utilizzare una pipetta per regolare la concentrazione di vermi su circa 40 animali per 100 microlitri di mezzo K.
Aggiungere 50 microlitri del mezzo preparato in ogni pozzo della piastra da 384 pozza. Questi vermi sincronizzati a stadio L4 sono pronti per il trattamento da parte di sostanze chimiche. Prima di aggiungere le sostanze chimiche, posizionare la piastra a 384 pozzi, con i vermi sincronizzati sul palco automatico, e impostare la videocamera con la procedura di acquisizione programmata.
Nella piastra da 384 pozzi, i vermi vengono trattati con da sei a sette dosaggi di ogni singola sostanza chimica, con otto pozzi paralleli contenenti 50 microlitri della soluzione due volte chimica per ogni dosaggio. Preparare almeno tre gruppi di otto pozzi paralleli di mezzo K come controllo. Aggiungere 50 microlitri della soluzione due volte chimica per ogni pozzo.
Impostare l'ora come punto dell'ora zero. Quindi, metti la piastra da 384 po 'nello shaker dell'incubatore impostata a 20 gradi Celsius e 80 giri al minuto. Dopo un tempo desiderato, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferirla allo stadio automatico.
Scatta video di ogni pozzo del piatto, a 12 ore e a 24 ore per controllare i fenotipi dei vermi. Per iniziare a elaborare il video sperimentale, trasferire i file video sul computer. Tramite l'interfaccia utente grafica, fare clic sul pulsante Seleziona, per scegliere la directory delle immagini di origine.
Aggiungere la directory dei risultati centrale. I risultati intermedi includono le immagini segmentate, che sono utili per l'osservazione visiva delle immagini elaborate. Aggiungere la directory dei risultati finali nell'interfaccia.
Impostare il parametro di dimensione media del worm su 2.000 nella casella di testo Dimensioni worm nell'interfaccia. Impostare la soglia del rapporto spostato su 0,93 nell'interfaccia. Fare clic sul pulsante Analizza per avviare l'elaborazione dell'immagine.
Il programma sviluppato può riconoscere i worm e quantificare automaticamente i fenotipi. In questo esperimento, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per il trattamento con cloruro di cadmio in tre punti di tempo, zero ore, 12 ore e 24 ore. Immagini sperimentali mostrano che i vermi sono morti più rapidamente con l'aumentare della concentrazione chimica.
All'inizio, non c'era alcuna differenza significativa tra il controllo e i trattamenti chimici. Dopo 12 ore di trattamento, i vermi trattati con un'alta concentrazione sono diventati più dritti e meno curvi rispetto a concentrazioni più basse o in gruppi di controllo. La maggiore lunghezza dell'asse della regione coperta dal corpo del verme è aumentata con l'aumentare del tempo.
C'è anche una tendenza al gradiente da concentrazioni chimiche più basse a concentrazioni più elevate sia nell'asse principale che nella lunghezza dell'asse minore. La motilità dei vermi, basata sull'area e sul rapporto, mostrava schemi simili. All'inizio non è stata osservata alcuna differenza significativa.
Con il passare del tempo, i vermi nel gruppo di controllo mostravano una diminuzione stabile della motilità. Dopo 12 e 24 ore, i vermi trattati con cloruro di cadmio hanno mostrato differenze significative nella motilità, rispetto ai gruppi di controllo. Inoltre, i vermi sotto trattamenti a concentrazione più elevata hanno mostrato una motilità più debole, rispetto ai vermi sotto trattamenti a bassa concentrazione.
In sintesi, questa tecnica apre una via di rapida valutazione della tossicità in più aree. Ricercatori che potrebbero applicare il metodo all'analisi di emergenza della tossicità nella tossicosi di origine alimentare, alla valutazione della sicurezza dei composti farmaceutici, nonché allo screening della tossicità acuta e all'individuazione di nuove sostanze chimiche e ai composti esogeni ambientali. Il cloruro di cadmio è una sostanza a bassa tossicità.
Si prega di indossare guanti e una maschera durante la manipolazione e seguire le istruzioni per l'uso.
