Il test di protrusione del bordo cellulare ha dimostrato di essere direttamente correlato alla migrazione cellulare. Pertanto può essere utilizzato come metodo preliminare per identificare proteine critiche e meccanismi di segnalazione coinvolti nella motilità cellulare. Il metodo è veloce, semplice, economico e non richiede l'etichettatura fluorescente o l'utilizzo di un costoso microscopio fluorescente.
A dimostrare la procedura sarà Michal Gendler, uno studente del mio laboratorio. Aggiungere due millilitri di una normale soluzione di acido cloridrico al centro di un piatto con fondo di vetro e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare il piatto tre volte con due millilitri di PBS.
Diluire la fibronectina a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS e aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita alla parabola centrale di vetro. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare la soluzione 1%BSA e PBS e passarla attraverso un filtro da 0,2 micrometri.
Denaturare la soluzione incubando a 70 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno d'acqua preriscaldato. Lavare il piatto inferiore in vetro rivestito con due millilitri di PBS tre volte. Aggiungere due millilitri di soluzione BSA denaturata e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare il piatto di vetro con due millilitri di PBS tre volte. Prima di 16-18 ore di esperimento a 0,7 milioni di cellule per piastra di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro per raggiungere il 70-80% di confluenza. Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina alla piastra di coltura tissutale e incubare per due o tre minuti fino a quando le cellule si staccano.
Aggiungere cinque millilitri del mezzo per inattivare la tripsina. Usando un emacitometro, conta le cellule e la piastra 20.000 cellule in due millilitri del mezzo completo in un piatto inferiore. Quindi incubare il piatto con cellule placcate in un'incubatrice per 15 minuti.
Accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 gradi Celsius un'ora prima dell'imaging. Inoltre, accendere l'unità di anidride carbonica e impostarla al 5% 10 minuti prima dell'imaging. Accendere il microscopio e la fotocamera.
Accendere il computer e aprire il software di acquisizione del microscopio. Impostare l'ingrandimento su un contrasto di fase dell'obiettivo secco 40X. Imposta la durata totale del filmato su 10 minuti con un intervallo di tempo di cinque secondi.
Dopo 15 minuti di incubazione, posizionare il piatto di fondo di vetro con cellule aderenti in un adattatore e fissarlo. Inserire l'adattatore con la parabola nelle fessure dello stadio del microscopio. Togliere il coperchio del piatto, posizionare il coperchio dell'anidride carbonica e aprire la valvola dell'anidride carbonica.
Individuare una cella appropriata per l'imaging. Avviare l'acquisizione del filmato dopo essersi concentrati sulla cella. Per eseguire l'analisi dell'immagine, selezionare lo strumento dritto nel software di analisi delle immagini e creare otto linee di 20 unità arbitrarie perpendicolari alle sporgenze in una disposizione radiale ogni 45 gradi, tra cui lamella e bordo della cella.
Nella barra degli strumenti principale, vai all'immagine, seleziona Stacks e quindi fai clic su Reslice per generare un'immagine del kymograph che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare. Utilizzando le immagini del kymograph, estrarre e contare manualmente il numero di sporgenze, retrazioni e volant in ciascuna delle otto regioni della cella contrassegnate dalle linee della griglia. Questi numeri rappresentano la frequenza di sporgenze, retrazioni e volant per 10 minuti.
Determinare la persistenza, la distanza e la velocità della protrusione mediante l'analisi della chimografia. Per determinare la distanza di protrusione, disegnate la linea perpendicolare dalla base della protrusione al picco più alto della protrusione. Premere M per misurare la lunghezza della linea in pixel e assicurarsi che il rapporto pixel/micrometro sia noto per convertire la lunghezza in micrometri.
La quantificazione di sporgenze, reazioni e volant è stata eseguita manualmente per 10 minuti e la frequenza media ottenuta per sporgenze e retrazioni è stata di 5,1 e 2,1 per volant. Il kymograph rappresentativo aveva una distanza di protrusione di circa 4,8 micrometri e un tempo di protrusione di circa 0,6 minuti. Viene rappresentato un esempio di cella che deve essere esclusa dall'analisi.
L'analisi della chimografia ha rivelato che la cellula non era presente nella sua fase di diffusione e non ha mostrato alcuna chiara protrusione della membrana. La cosa più importante è scegliere le cellule corrette per l'imaging. Una cellula corretta dovrebbe essere nella sua fase di diffusione e non dovrebbe toccare altre cellule per evitare la comunicazione e la segnalazione cellula-cellula.
Il metodo può essere utilizzato come strumento preliminare per testare la dinamica citoscheletrica che coinvolge la motilità cellulare prima di decidere di eseguire più risultati richiedendo saggi di migrazione cellulare.
