Lo sviluppo di qFSM è finanziato dalla sovvenzione NIH U01 GM06230.

Sezione 1: Ottenere il vostro actina fluorescente per FSM Materiali richiesti: purificato actina, fluoroforo (Alexa, X-rodamina consigliato). G-buffer, ultracentrifuga <ol><li> Un componente chiave per l&#39;acquisizione di filmati FSM buona impone l&#39;etichettatura corretta di actina (o altre proteine ​​del citoscheletro) con il fluoroforo di vostra scelta. Si consiglia di utilizzare fluorofori di Alexa (488, 568 lunghezze d&#39;onda) e X-rodamina derivati ​​esteri succinimidile che l&#39;obiettivo esposto residui di lisina sulla superficie di actina. </li><li> Quando scegli il tuo fluoroforo e la sua lunghezza d&#39;onda appropriata, assicurarsi che la configurazione microscopio ha i filtri appropriati (eccitazione ed emissione) e illuminatori (lampade a vapori di mercurio e / o laser) per soddisfare le vostre tag fluorescenti. Si consiglia di selezionare le lunghezze d&#39;onda del rosso arancione per lunghezze d&#39;onda (560-630 nm) per minimizzare gli effetti di auto-fluorescenza e foto-danni e per assicurare la sua compatibilità con GFP-coniugati. </li><li> Actina pura può essere estratto dal tessuto muscolare appartenente al ratto o di pollo, ma richiede una lunga procedura di estrazione di polvere muscolare acetone. Acetone polvere muscolo può essere acquistato da Invitrogen. La procedura di etichettatura non è discusso in questo protocollo, ma può essere trovato qui [1] </li><li> In alternativa, è possibile acquistare proteine ​​actina etichettato da molti editori tra cui Citoscheletro Inc. e Invitrogen. Servizi di etichettatura personalizzati sono disponibili anche tramite Invitrogen. Purificata, non marcata actina (actina sia muscolare e non muscolari) possono essere acquistati presso citoscheletro Inc. </li><li> Se si decide di acquistare o preparare il actina propria etichetta, si vuole assicurare che il rapporto di etichettatura è da qualche parte intorno 0,3-0,7 coloranti per monomero di actina. Troppo alto rapporto di etichettatura può effettuare la cinetica fatturato (e di legame con le proteine ​​associate) del filamento di actina, mentre troppo bassa con un rapporto di etichettatura porterà a poveri puntini guardando (basso segnale al rumore) e può causare problemi di microiniezione (vedi sotto). Questo è un fattore critico per ottenere una buona speckle immagini. </li><li> Prima di stoccaggio a lungo termine, la soluzione actina etichetta dovrebbe essere chiarita facendo girare a 75.000 - 80.000 xg per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Actina etichettati devono essere conservati in G-soluzione tampone e tenuti -80 gradi Celsius. Preparazione di 2 aliquote uL è altamente raccomandato per ridurre gli effetti negativi di ripetute gelo-disgelo (porta ad aggregati insolubili). Evitare di esporre la soluzione actina marcato alla luce diretta (che photobleaching di fluorofori). Si consiglia di utilizzare tubi microcentrifuga opaco per una conservazione a lungo termine. </li></ol> Sezione 2: Preparazione di cellule e Microiniezione di actina etichettati Materiali richiesti: gli aghi microiniezione, microsiringa, microloaders, media cellula preriscaldata, buffer di iniezione, secchio di ghiaccio, microscopio (anello di fase, contrasto di fase obiettivo 40X, transjector, ago estrattore, micromanipolatore) <ol><li> Molti tipi di cellule sono suscettibili di FSM, ma ottenere buone immagini speckle dipende direttamente il successo della procedura di microiniezione. Quando si selezionano le celle per FSM, le cellule devono essere di grandi dimensioni (&gt; 50 um di diametro), dovrebbe diffondersi quando placcato, ed essere naturalmente aderente al substrato (o piatti di plastica coltura dei tessuti). Aiuta anche se citoplasma della cellula occupa una superficie superiore al suo nucleo. I criteri di cui sopra in modo che le cellule sono suscettibili di microiniezione. Successo linee cellulari candidato include (ma non solo) PtK1 [2,3], le cellule polmonari tritone [4], e neuroni Aplysia [3]. </li><li> Le cellule devono essere placcato sul coprioggetto di vetro quadrata (22 x 22 mm;. Non 1-1/2) che sono stati lavata con acido. Rivestimento substrato standard può essere applicato al vetrino e non influenzerà microiniezione. </li><li> La corretta scelta di aghi microiniezione dipende dalle dimensioni della punta di apertura. Tipicamente, le dimensioni dei fori può molto nel formato da 0,5 um alla grande come 3 um. Tuttavia, si consiglia che l&#39;iniezione di actina richiede una dimensione ottimale di apertura tra 0,5 e 1 um. Se i problemi di intasamento si incontrano costantemente, le dimensioni dei fori più grandi in grado di ospitare per la consegna di monomerico così come indesiderati filamenti di actina polimerizzata. Microiniezione aghi possono essere acquistati attraverso diversi fornitori, compresi i sistemi Eppendorf che rendono gli aghi microiniezione femtotip. In alternativa, se un estrattore ago commerciali è disponibile, tubi di microiniezione di vetro possono acquistato da Sutter, e tirò le specifiche. Per i principianti, si consiglia di avere 10-20 aghi tirati a portata di mano prima di iniziare la procedura di iniezione. </li><li> &#39;Concentrazione di iniezione&#39; ideale (concentrazione finale di actina caricata nel vostro ago) di actina è compresa tra 0,5-1,0 ug / ul sulla base di un rapporto di etichettatura del 40% di tintura di monomero di actina. Rapporto di etichettatura inferiore del actina può essere compensata mediante iniezione a concentrazioni più elevate (1-3 ug / ul). Tuttavia, la frequenza intasamento del vostro ago siessere aumentata. Questo può essere in parte alleviati utilizzando aghi con le grandi aperture. Concentrazione stock di actina può essere diluita con l&#39;aggiunta di ghiaccio freddo buffer di iniezione. Ghiacciata ddH2O può essere utilizzato anche per diluire per preparazioni iniettabili veloce. A questo punto tutte le soluzioni di lavoro devono essere tenuti in ghiaccio. </li><li> Carico 0,5-1,0 uL della soluzione di actina con una microsiringa (a scartamento ridotto - Hamilton), o in alternativa utilizzando una punta microloader pipetta. </li><li> Dispensare con cura la soluzione actina, delicatamente rilasciando la soluzione. Bolle dovrebbe essere evitato, ma può essere facilmente rimosso prendendo il liquido in eccesso che circonda la bolla. </li><li> Garantire che la soluzione actina è completamente a riposo la punta dell&#39;ago. Soluzione in eccesso ovunque lungo il capillare dell&#39;ago può interrompere il flusso di iniezione. </li><li> Ora, collegare l&#39;ago con cura, evitando il contatto con la punta dell&#39;ago, al titolare iniettore. Posizionare il supporto in modo che l&#39;ago fa un angolo di 35-50 gradi alla base del palco microscopio. Angoli inferiori sono da preferire. </li><li> Abbassare la punta dell&#39;ago finché non si rompe appena la superficie del supporto balneari vostre cellule. </li><li> Ora la posizione della punta dell&#39;ago (senza abbassare) in modo che poggia direttamente sopra il centro dell&#39;obiettivo. Se la punta dell&#39;ago sia allineato con l&#39;obiettivo, si dovrebbe vedere un alone luminoso attraverso l&#39;oculare. Questa è la fine della punta dell&#39;ago. Lentamente la parte dell&#39;ago a lato (utilizzando il manipolatore) può aiutare a meglio individuare l&#39;aureola. </li><li> Regolare la z-focus sul microscopio fino a quando le cellule sono in chiara visione. Ora, abbassare lentamente la punta fino a quando l&#39;alone restringe via via fino alla fine convergono in punta dell&#39;ago - è necessario controllare la messa a fuoco (z-position) contemporaneamente. Un ulteriore elemento atto a cercare è l&#39;albero dell&#39;ago, che proietteranno ombre lineare. Abbassare l&#39;ago a poco a poco definire l&#39;albero ago. Se fatto correttamente la fine del l&#39;ago e le cellule devono essere entrambi in chiara visione. Leggero aggiustamento dell&#39;anello di fase può essere necessaria per migliorare il contrasto. </li><li> Durante la navigazione, assicurare la punta dell&#39;ago è ben al di sopra vostre cellule per prevenire rotture punta dell&#39;ago. </li><li> Quando si sceglie di iniettare le cellule, le cellule con bordi liberi deve essere rivolto verso la punta dell&#39;ago. Questo garantirà pendenza declino della cellula (dal punto più spesso, in cui risiede il nucleo, il punto più sottile bordo d&#39;attacco) si riunirà la punta dell&#39;ago, piuttosto che correre in parallelo ad esso. </li><li> La pressione ago deve essere fissato a 0,3-0,8 psi. La pressione costante applicata si tradurrà in un flusso costante della soluzione actina. </li><li> Dopo aver deciso su una cella per iniettare, posizionare l&#39;ago in modo che il consiglio si trova accanto al nucleo (regione perinucleare, parte più spessa della cella in cui il nucleo non è direttamente sotto). </li><li> Abbassare lentamente, e regolare la posizione dell&#39;ago fino a quando la punta è deprimente la membrana, ora in modo incrementale inferiore fino a quando la punta dell&#39;ago ha forato la membrana. Se l&#39;ago ha perforato la membrana, la cellula apparirà più luminosa, appena vedete questa differenza sollevare l&#39;ago fino a quando non è più toccare il cellulare. Il piercing attuale e il processo di iniezione si ,5-2 secondi. </li><li> Se fatto correttamente, la forma della cellula appare immutato, mentre le iniezioni troppo si tradurrà in retrazione rapida del bordo delle cellule e in alcuni casi sarà effettivamente vedere la cellula esplodere. </li><li> Se non vedi cambiamenti nella cella quando microinjecting (non più luminosa), la punta dell&#39;ago può essere chiuso. È possibile verificare questo premendo il tasto &#39;pulita&#39; se disponibile sul transjector. Se aperto, questo aumenterà notevolmente il flusso costante della pressione che può essere visto attraverso gli oculari - apparirà come increspature e detriti vicino può essere visto dispersione. </li><li> Se la punta dell&#39;ago è chiuso, è possibile scegliere di inserire un nuovo ago microiniezione o tentare di violare la punta dell&#39;ago delicatamente abbassando l&#39;ago fino alla punta delle presse aghi contro il coprioggetto di vetro, provocando così la fine della punta per rompere. La zona di rottura dovrebbe essere non più di un 1 / 5 ° della zona del punto ago (la parte dell&#39;ago che inizia a convergere verso un punto). </li><li> Continuare con l&#39;iniezione, spendendo non più di 20 - 45 minuti per ogni sessione di microiniezione (dipende dal tipo di cellula). Come regola generale, più brevi sessioni sono raccomandate per ridurre al minimo lo stress sulle cellule. </li><li> Dopo aver terminato la microiniezione, cambiare il supporto delle cellule nel piatto con l&#39;aggiunta di nuovi mezzi di comunicazione preriscaldata. Poi consentono alle cellule di recuperare per 30 minuti in un incubatore prima di imaging. Ciò consentirà anche l&#39;actina di integrare nella rete esistente citoscheletro. </li></ol> Sezione 3: Assemblaggio della Camera Imaging Materiali richiesti: coprioggetti, nastro biadesivo, q-punte, pinze, valap, kim wipe, oxyrase, immagini dei media, lama di rasoio, p200 pipette, etanolo puro <ol><li> Inizia preriscaldamento dei media di imaging e scongelamento di 15 uL aliquota di Oxyrase. Accertarsi di proteggere i oxyrase fotosensibile dalla luce. L&#39;aggiunta di oxyrase ridurrà di molto gli effetti della photobleaching. </li><li> Preriscaldare il valap, impostando la temperatura piastra calda a bassa. Non surriscaldare / bruciare il valap per essa perderà la sua efficacia come sigillante. </li><li> Pulire il coprioggetti con un kimwipe bagnato con etanolo puro per pulire e rimuovere i detriti di piccole dimensioni. </li><li> Impilare due lunghezze uguali dimensioni (2,5 cm di lunghezza) di nastro biadesivo sulla parte superiore di ogni altro, con una superficie piana pulita come piattaforma. Spremere eventuali bolle d&#39;aria intrappolate per creare un piano completamente piatto. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, tagliate due strisce dritto lungo l&#39;asse longitudinale, in modo che ogni striscia misura 0,5 centimetri di larghezza. </li><li> Utilizzando pinze, luogo ogni striscia contro il bordo lungo del coprioggetti in modo che le due strisce di nastro crea un vuoto nel centro della vostra coprioggetti. Premere delicatamente sul nastro per fare un bel sigillo con il vetro. Le strisce di nastro agirà come distanziatori tra il coprioggetti e il coprioggetto. </li><li> Assicurarsi che il valap ha completamente liquefatto prima di iniziare il prossimo passo. </li><li> Recuperare i file multimediali di imaging preriscaldata, aggiungendo 15 ul di oxyrase ad ogni uL 500 di media. </li><li> Kimwipes piega in triangoli di creare 3 bordi duri. Questo sarà utilizzato per creare una superficie asciutta per il nastro di incollare. </li><li> Recuperare le cellule dal termostato. Utilizzando pinze, afferrare un angolo del coprioggetto. Rapidamente il posto su un vetrino kimwipe (lato cella è rivolto verso l&#39;alto, senza toccare i tessuti), e utilizzare il kimwipe piegato per pulire due lati opposti del vetrino per creare un semi-secco superficie (sulla superficie dove il vostro riposo cellule). </li><li> Utilizzando pinze, afferrare un angolo il coprioggetto e posizionarlo sul coprioggetti in modo che le superfici asciutte sono allineati a due strisce di nastro. Si noti ora si hanno due lati chiusi e due fessure aperte. Lentamente Pipettare 200 ul di soluzione di imaging-media-oxyrase vicino ad una apertura. Soprattutto, assenza di bolle d&#39;aria dovrebbe essere introdotta. La soluzione deve essere aspirato nella camera appena assemblato da forze capillari, immergendo in tal modo le cellule in soluzione. </li><li> Utilizzando un Q-tip tamponare i quattro angoli del coprioggetto con valap fuso apporre in modo rapido e stabilizzare il coprioggetto. Noterete che le asciuga valap istantaneamente (in pochi secondi a temperatura ambiente). </li><li> Ora comincia con i lati aperti (non nastro lato), c&#39;era una sottile striscia di valap utilizzando un Q-tip e mimando un colpo di spazzola. Ripetere l&#39;operazione per i lati chiusi. Lentamente costruire la mano di valap, rafforzando così il sigillo ripetendo i passaggi di rivestimento. Il valap deve essere limitato ai bordi, lasciando al centro del coprioggetto chiaro. </li><li> Pulire delicatamente la parte centrale del vetrino utilizzando un Q-tip con ddH2O di rimuovere il media residua, essere attenti a non rompere le cellule. Ripetere la pulizia passo con etanolo puro. </li><li> Ora avrete una camera di imaging completamente chiusa ottimizzata per speckle imaging. Avere un involucro completamente sigillato impedisce al fluorofori da subito photobleaching. </li></ol> Sezione 4: cellule Imaging Materiali richiesti: microscopio invertito widefield, lampada mecury, filtri del caso, raffreddato CCD con pixel di 6,7 micron, ad alta apertura numerica, olio-immersion piano-apocromatico obiettivi (60X a 100X, fase o DIC). Vibrazioni tavolo. Software di imaging. <ol><li> Preriscaldare il palco microscopio a 37 gradi. Inserisci la tua camera di imaging recentemente completato, e attendere 10-15 minuti per la temperatura si stabilizzi prima di imaging. </li><li> Inizio mettendo a fuoco le tue cellule a Bright-campo, e poi trovare le cellule iniettate commutando le impostazioni corrette fluorescenza. Cercare di minimizzare il tempo di esposizione fluorescenza per ridurre photobleaching. </li><li> Ricerca di cellule iniettate che sono sani bordi curvi leader. Over-iniettate cellule (cellule esploso) sarà caratterizzata da bordi frastagliati e retratto, simile filopodia numerosi - evitare di imaging queste cellule. </li><li> Impostazioni di acquisizione dipenderà dal tipo di cellula, la qualità della actina marcato, e componenti del microscopio. Tuttavia, le impostazioni di esposizione non deve essere superiore a 2 secondi, e l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere impostato tra 5 e 10 secondi. Lunghezze tipiche di una serie temporale (per cella fotografato) può variare dai 10 ai 30 minuti, ed è limitata dagli effetti photobleaching. Impostazioni di guadagno sulla fotocamera può essere attivata fino a aumentare il segnale al rumore. </li><li> Ideale speckle caratteristiche dovrebbe avere ogni speckle intervallata da ~ 2 speckle diametri alla vicina prossimo speckle. Questo garantisce ottimale di campionamento spaziale e temporale della struttura di actina. Per le cellule epiteliali, la rete di actina punteggiato apparirà omogeneo, con macchie uniformemente divaricate. Linee cellulari che dispongono di fibre di stress densa o lamellipodiasaranno distinguibili, ma avrà un aspetto punteggiato / maculato. Le impostazioni di esposizione deve essere regolata per ottenere le migliori immagini punteggiato. </li><li> Over-microiniettati cellule avranno macchie fitte, che non sembrano essere discreti. Fibre di stress e la lamellipodia perderà il suo aspetto punteggiato. </li><li> Under microiniettati cellule apparirà molto fioca attraverso l&#39;oculare, contenente macchie che sono distanti tra loro (&gt; 10 macchie a parte) e appaiono casualmente sparsi. Fibre di stress e la lamellipodia in queste cellule non sarà diversa. </li><li> Chiave per ottenere &#39;buono&#39; speckle film mantiene a fuoco. Ciò è particolarmente importante per la post-analisi che coinvolgono speckle flusso e misure fatturato. Così la qualità dell&#39;analisi quantitativa dipenderà blocco nel punto di riferimento per tutta la durata del time-lapse. Questo può essere particolarmente difficile se il piano di imaging è molto sottile. Altri fattori dipenderà dalla stabilità del sistema microscopio, in particolare l&#39;alloggiamento palco e la camera di imaging. Contrasto a base di messa a fuoco può essere utilizzato se intervallo di lunghezze immagini sono sufficienti per accogliere questa funzione. Altre opzioni includono l&#39;acquisto di un vicino infrarosso sistema basato messa a fuoco che fornisce affidabile modifiche in tempo reale messa a fuoco. È possibile trovare queste offerte da Nikon, Olympus e ASI. </li></ol> Sezione 5: analisi qFSM Questa sezione non è discusso in dettaglio, ma le informazioni sul software di analisi può essere trovato qui [5]. Richieste di download del software possono essere effettuate sul nostro sito (lccb.scripps.edu). Argomenti trattati: <ul><li> Rumore di calibrazione </li><li> Speckle rilevamento </li><li> Monitoraggio utilizzando un approccio ibrido tra immagine correlazione basata tracciamento del moto di grossa speckle aree e monitoraggio singola particella del moto dettagliata di macchie individuali. </li><li> Calcolo del gruppo di polimeri e dei tassi di smontaggio dalle fluttuazioni di intensità durante speckle comparsa e scomparsa eventi. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Diversi sono i fattori chiave fondamentale per riuscire a ottenere immagini speckle, per quanto buone macchioline iniziano e terminano con la qualità della vostra actina fluorescente. Un rapporto di etichettatura elevati di colorante di actina monomero, disposti intorno a 0,4-0,7 farà in modo che puntini apparirà luminoso e discreto, mentre la proteina etichettata stesso dovrebbe essere solubile e priva di aggregati. Altrettanto importante è la procedura di microiniezione. Per assicurare la normale omeostasi cellula...

Iniezione del buffer (IB) 50 mM glutammato di potassio 0,5 M MgCl2 (ALLEGATO 2A) Memorizzare fino a 2 anni a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (ALLEGATO 2A) 0,2 mM CaCl2 (ALLEGATO 2A) Aggiungi al momento dell&#39;uso: 0,2 mm ATP (vedi ricetta per 100 mm) 0,5 mM di 2-mercaptoetanolo Memorizzare fino a 1 giorno a 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

In questo protocollo si descrivono l&#39;uso della microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) di catturare immagini ad alta risoluzione delle dinamiche di actina in cellule PtK1. Un vantaggio unico del FSM è la sua capacità di catturare il movimento e la cinetica fatturato (montaggio / smontaggio) della F-actina rete all&#39;interno delle cellule viventi. Questa tecnica è particolarmente utile nel derivare misurazioni quantitative di F-actina dinamiche se abbinato con il software di visione artificiale (qFSM). Descriviamo la, microiniezione selezione e la visualizzazione di sonde fluorescenti actina in cellule viventi. È importante sottolineare che le procedure siano applicabili alla visualizzazione assemblee macomolecular altri. FSM è stata dimostrata per microtubuli, filamenti intermedi, e complessi di adesione.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selezione, microiniezione, e l&#39;imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.8K Views.  Scripps Institute. Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

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Biologia

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...