Ringraziamo il professor Hiraoka per averci inviato ceppi. Noi riconosciamo il sostegno della Fondazione Gustafssons Goran e la Cancer Society svedese (2008/939).

1. Fissione lievito madre <ol><li> Preparare Edimburgo minima Media (EMM) e EMM senza ammoniumchloride (EMM-N) 8. Per ridurre autofluorescenza la soluzione di glucosio non deve essere sterilizzato in autoclave ma invece filtro sterilizzato usando un filtro di 0,2 micron e, successivamente, aggiunti ai media sterilizzati in autoclave. </li><li> Inoculare cellule di lievito di fissione appena cresciute su una piastra di agar con rich media, YEA 8, in 3 ml di EMM liquidi con filtro glucosio sterilizzati. Utilizza tubi 13ml con una leggera spinta sul cappuccio per garantire una buona ventilazione delle celle. Lasciate che le cellule crescono agitando con 225 giri in 30 ° C. Mantenere le cellule crescono in fase di log (1 X 10 6 - 2 X 10 7 cellule / ml) per 2 giorni contando utilizzando una camera di Burker seguito da opportuna diluizione, ogni mattina e sera. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento assicurarsi di avere cellule in fase di log primi, 5 X 10 6 - 1 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Morire di fame tche le cellule per l&#39;azoto durante i 20 minuti dal passaggio di mezzi di comunicazione EMM EMM-N media. Questo è fatto da 3 ml di raccolta di cellule in una provetta 1,5 ml Eppendorf in una centrifuga da banco al massimo 1,5 rcf come centrifugazione ad una velocità più rapida potrebbe indurre una risposta allo stress nel lievito di fissione 9. Utilizzare la tecnica doppio filatura, significato, primo giro di 2 minuti, quindi ruotare il tubo Eppendorf 180 ° e far girare di nuovo per 1,5 rcf 2 min 10. Questo aiuta a raccogliere tutte le celle in una pellet sul fondo della provetta. Lavare una volta con EMM-N e poi sciogliere il precipitato in EMM-N e incubare le cellule per 15 minuti a 30 ° C agitazione a 225 rpm e poi proseguire al punto 2. Preparazione del campione. </li></ol> 2. Preparazione del campione <ol><li> Harvest 1,5 ml di cellule in una provetta da 1,5 ml Eppendorf in una centrifuga da banco al massimo 1,5 rcf come centrifugazione ad una velocità più rapida potrebbe indurre una risposta allo stress nel lievito di fissione 9. Utilizzare la tecnica doppio filatura, Meaning, primo spin per 2 minuti, quindi ruotare il tubo Eppendorf 180 ° e far girare di nuovo per 1,5 rcf per 2 min 10. Questo aiuta a raccogliere tutte le celle in una pellet sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere il surnatante, ma lasciare 10-15 microlitri e risospendere le cellule del materiale rimanente. In alternativa, aggiungere 10 ml di mezzi freschi per risospendere il pellet cellulare. </li><li> Assicurarsi di avere diapositive in vetro trasparente e copertura in vetro (non 1,5). Normalmente non è necessario pulirli, ma assicurarsi che non sono pieni di polvere. </li><li> Togliere dal freezer una aliquota di una soluzione madre di lectina 1mg/mL che è stata filtro sterilizzato. La soluzione lectine possono essere ricongelati più volte. La lecitina è usata per fissare le cellule di lievito al vetro di copertura. </li><li> Mettere 5 ml di glucosio EMM con filtro sterilizzato sul vetro obiettivo. </li><li> Mettere 5 ml di soluzione di lectina in un angolo del vetro di copertura. Successivamente posto 5 ml di colture cellulari nello stesso angolo, vale a dire il calo lectina. Mescolare pipettando un paio di volte e poi diffondere la coltura cellulare-lectina mix tutto il vetro di copertura, utilizzando il lato lungo del puntale. A seconda della densità della miscela cellule lasciare tutto o aspirare il liquido in eccesso in un angolo opposto del vetro di copertura. </li><li> Posizionare il vetro di copertura, in alto, con un lato sul vetro obiettivo e l&#39;altro in panchina. Lasciate che il vetro di copertura a secco un po &#39;per qualche minuto. Non deve assolutamente essere completamente asciutto, ma non dovrebbe essere troppo liquido sul vetro. </li><li> Posizionare il vetro di copertura con un angelo circa 70 ° rispetto al vetro obiettivo la goccia di EMM. Lasciate andare il vetro di copertura in modo che cada dall&#39;alto verso il basso nella goccia di EMM. </li><li> Per sigillare i bordi con grasso al silicone preparare una siringa da 2 ml. Tagliare la parte più larga di una punta di 200 l ed allegarlo alla siringa. Riempire la siringa con circa 1 ml di grasso al silicone. Una linea sottile di silicio viene applicato ai bordi del vetro di copertura con delicatezza pushing il pistone della siringa. Ora avete una piccola camera di crescita di S. pombe cellule. </li></ol> 3. Microscopia <ol><li> Inizializzare la microscopia a fluorescenza, attivando il mercurio / lampada allo xeno, il microscopio e il computer. Posizionare la camera di crescita del lievito al microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo 63 X o un 100 X con obiettivo NA = 1.3 o superiore. Se un obiettivo è utilizzato l&#39;olio, aggiungere l&#39;olio. </li><li> Utilizzare il campo luminoso per trovare le cellule e ottenere una foto nitida. </li><li> Le impostazioni per la microscopia a fluorescenza variano a seconda del fluorocromi usati per etichettare le cellule di lievito e il microscopio. Usiamo un microscopio confocale Zeiss LSM 700 Microscopio Scansione Laser con Plan-Apochromat lente 63x obiettivo di olio (NA = 1,4) con il 16-linea di impostazione media di scansione aereo. Il foro deve essere impostato a 1-1,1 unità Airy, che dà una fetta ottico di 0,8 mm. Rileviamo GFP in pista 1 usando il set di filtri per Alexa 488 con un divisore di fascio a 582 nm, in modo detecting lunghezze d&#39;onda tra 488 e 582 nm. In pista 2 si usa un set di filtri ottimali per mCherry utilizzando un divisore di fascio a 578 nm, in modo da rilevare le lunghezze d&#39;onda tra 578 e 600 nm. Ciò significa che in traccia 2 sia il MRFP (SPB) e NM (mCherry) verrà rilevato. </li><li> Prendere come molte immagini dovevano essere in grado di misurare in 60 celle diverse per ogni ceppo. Di solito 15 immagini dei campi di microscopia indipendente sono sufficienti. Si consiglia una camera nuova crescita con cellule fresche viene fatta se il vostro tempo microscopia supera i 60 minuti. </li></ol> 4. Misurazione quantitativa delle distanze subcellulari <ol><li> Aprire le immagini in Zen programma Light Edition Zeiss. Utilizzando lo strumento di misurazione misura la distanza in micron tra i fluorocromi diversi in tutte le celle in cui tutti i segnali sono sullo stesso piano focale. Regolare l&#39;intensità della luce e il contrasto di individuare il centro del segnale fluorescente. Questo protocollo semplificato utilizza solo due diversi cOLORI e quindi la SPB e NM sono nello stesso canale. SPB è individuata dal suo grande struttura rotonda nel NM. Trasferire le distanze a un foglio notepad. Misura in almeno 60 celle. Altri programmi come ImageJ potrebbe essere utilizzato anche per misurare la distanza, ma Zeiss Luce Zen è preferito a causa della sua maggiore risoluzione dell&#39;immagine e la facilità di zoom avanti e indietro utilizzando tale programma. Immagini in formato LSM aperto nel ImageJ avranno i due canali su uno sopra l&#39;altro. Per fare una foto con entrambi i canali, in primo luogo dividere i due canali e successivamente unirli. Successivamente lo strumento linea può essere usato per misurare le distanze come descritto sopra. </li><li> Confrontare le distanze medie o medio subcellulare tra ceppi diversi e trattamenti a base di un programma statistico, ad esempio t-test o test di Mann-Whitney della somma dei ranghi, ad esempio utilizzando il SigmaStat-3.5 del software. Spesso i dati non sono distribuiti normalmente poiché ci sarà una selezione per le cellule più brevidistanze tra i segnali fluorescenti in quanto tutti i segnali devono essere sullo stesso piano focale da misurare. Una t-test può essere utilizzato solo quando i dati sono una distribuzione normale, mentre un test Mann-Whitney della somma dei ranghi permette la comparazione di serie di dati che non hanno distribuzione normale. In un t-test la media di due diverse serie di dati vengono confrontati durante una di Mann-Whitney rank test Somma la mediana è confrontato. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Strain PJ1185: (h his7 + +:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + Laco hphMX6] sid4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) è stato coltivato in EMM . Un campione è stato ritirato e montato in una camera di crescita di piccole e le immagini sono state scattate (Fig. 1A + N). Successivamente i mezzi di crescita è stato sostituito con EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), e le cellule sono state grown per 15 minuti agitando. Le cellule affamate di azoto sono state poi montate in una camera di crescita con EMM-N e le immagini sono state scattate (Fig. 1A-N). Lo strumento di misura è stato utilizzato per misurare la distanza tra il luogo (GFP) e l&#39;SPB (Fig. 1B e Tabella 1). Inoltre, la distanza tra il luogo (BPA) e il NM è stato misurato (Fig. 1B e Tabella 2). Le distanze mediana subcellulari prima e dopo l&#39;esaurimento di azoto sono stati confrontati utilizzando il-3.5 SigmaStat software (Tabella 3). C&#39;è stato un cambiamento statisticamente significativo nella localizzazione del cluster gene allontana dalla NM verso la SBP. I dati di misura la distanza tra la GFP e la SBP ha una distribuzione normale e, quindi, le distanze medie (1,777 micron + N e 1.587 micron-N) può essere paragonato con un t-test (Tabella 1 e 3). C&#39;è stata una differenza significativa tra i due valori medi (p = 0.008, t-test). I dati di misura la distanza tra la GFP e NM non ha avuto un normale distribution e quindi le distanze mediana (0 micron + N e 0,390 micron-N) sono stati confrontati con un test Mann-Whitney della somma dei ranghi (Tabella 2 e 3). C&#39;è stata una differenza significativa tra i due valori medi (P &lt;0,001, Mann-Whitney della somma dei ranghi). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Figura 1. La localizzazione di un cluster di geni chiamato Chr1, segnato da GFP, cambiato dopo la morte per fame di azoto. (A) Colonna sinistra, + N, un nucleo cellulare rappresentante di una cellula coltivata in EMM colonna di destra,-N, un nucleo cellulare rappresentante di una cellula coltivata in EMM-N. Il verde è il segnale GFP etichettatura del cluster Chr1, il rosso è il MRFP e mCherry etichettatura SPB e NM, rispettivamente. (B) nucleo della cellula Come (A), ma ora con distanze misurate subnucleare; giallo: il diametro del nucleo della cellula, il blu: la distanza tra SPB e GFP segnale e rosa: la distanza tra il segnale di GFP e la membrana nucleare. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> Tabella 1. Le distanze misurate in micron subnucleare del ceppo coltivato in PJ1185 EMM. Prima fila, diametro della cella (d), seconda fila, la distanza tra la GFP e la SPB, terza fila, la distanza tra la GFP e NM. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> Tabella 2. Le distanze misurate in micron subnucleare del ceppo coltivato in PJ1185 EMM-N. Prima fila, diametro della cella (d), seconda fila, la distanza tra la GFP e la SPB, terza fila, la distanza tra la GFP e NM. <imgalt = &quot;Tabella 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; Tabella 3. Statistiche descrittive delle distanze subnucleare osservata nel ceppo PJ1185 prima (+ N) e dopo (-N) fame di azoto. Prima riga: numero di cellule misurata, seconda fila: diametro medio (d), terzo fila: diametro mediano (d), via riga: distanza media tra la GFP e SPB, quinta fila: distanza mediana tra la GFP e NM.

<ol>
	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Durante l&#39;ultimo decennio l&#39;uso di immagini di cellule vive di monitorare eventi cellulari è diventato sempre più popolare. E &#39;iniziato con l&#39;uso della proteina verde fluorescente dalle meduse Aequorea victoria e ora molti fluorocromi differenti sono disponibili a fluorescenza che emette attraverso un ampio spettro di ciano (475 nm) al rosso di gran lunga (648 nm) 11. Uno dei principali vantaggi di imaging cellulare in diretta su immunofluorescenza è che le cellule non sono fissati da formaldeide o etanolo / acetone trattamento prima di microscopia, quindi evitando manufatti possibile dal processo di fissazione. Inoltre, l&#39;imaging cellulare dal vivo offre la possibilità di seguire le singole cellule e scattare foto ad intervalli frequenti durante le ore o giorni di incubazione, che permette di ottenere filmati di eventi cellulari 12. Cellule di mammifero hanno il vantaggio di avere una dimensione più grande, con un diametro di circa 100 micron, rispetto alla più piccola cellula di lievito con un diametro di circa 3-4 emu; m. D&#39;altra parte, il vantaggio con il genoma del lievito è facilmente manipolabile. Ricombinazione omologa avviene in modo molto efficiente nel lievito ed è utilizzato per fondere le proteine ​​di interesse a fluorocromi diversi 3. Inoltre, usando l&#39;integrazione mirata di sequenze Laco e successiva espressione di LacR-proteina GFP permette la rilevazione di una parte specifica del genoma all&#39;interno del nucleo delle cellule 2. Utilizzando S. pombe cellule in microscopia ha ulteriori vantaggi dal momento che sono naturali organismi unicellulari che crescono con un tempo di generazione veloce in condizioni di cellulari a basso costo cultura. Inoltre, S. pombe è un organismo modello eucariote eccellente poiché ha metazoi geni omologhi. Uno dei limiti principali di questa tecnica è autofluorescenza nella cellula di lievito disturbare la rilevazione del segnale vero. Questo problema può essere superato utilizzando terreni di coltura minimo con filtro glucosio sterilizzato invece di autoclave. InInoltre le cellule del lievito deve essere coltivate per 2 giorni in fase di log prima di montarli. Il protocollo qui presentata offre un metodo relativamente semplice, ma ancora quantitative per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine ​​all&#39;interno della cellula di lievito. Inoltre per scattare foto in diversi momenti siamo in grado di seguire gli eventi cellulari.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon grasso </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a scansione laser LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Altri microscopio confocale può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Qualsiasi software per l&#39;analisi statistica potrebbe essere utilizzato. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Tecniche di microscopia Diversi sono oggi disponibili in grado di rilevare una specifica proteina all&#39;interno della cellula. Durante l&#39;ultimo decennio di imaging cellulare dal vivo utilizzando fluorocromi come Green Fluorescent Protein (GFP) direttamente collegato alla proteina di interesse è diventato sempre più popolare 1. Mediante GFP e fluorocromi simili le localizzazioni subcellulari e dei movimenti delle proteine ​​può essere rilevato in un microscopio a fluorescenza. Inoltre, anche la localizzazione subnucleare di una certa regione di un cromosoma possono essere studiate usando questa tecnica. GFP è fusa alla proteina repressore Lac (LacR) e ectopica espresso nella cella in cui ripetizioni in tandem della sequenza Laco è stata inserita nella regione di interesse sul cromosoma 2. Il LacR-GFP si legano alle ripetizioni del Laco e quella zona del genoma sarà visibile come un punto verde nel microscopio a fluorescenza. Il lievito è particolarmente adatto per questo tipo di manipolazione perché omologhiricombinazione è molto efficiente e pertanto tale da consentire l&#39;integrazione mirata delle ripetizioni Laco e proteine ​​di fusione progettata con GFP 3. Qui si descrive un metodo quantitativo per l&#39;analisi di cellule vive di lievito di fissione. Protocolli aggiuntivi per l&#39;analisi di cellule vive di lievito di fissione si possono trovare, ad esempio su come fare un film dei 4 meiotico comportamento cromosomiche. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione subnucleare e come esso è influenzato durante l&#39;induzione del gene. Abbiamo un cluster etichettati gene, chiamato Chr1, con l&#39;introduzione di siti Laco legame in prossimità dei geni. Il cluster gene è arricchito per i geni che sono indotti precocemente durante la fame di azoto di lievito di fissione 5. Nel ceppo della membrana nucleare (NM) è etichettato con l&#39;attaccamento alla mCherry Cut11 proteina NM dando luogo a un segnale rosso fluorescente. Il Polo mandrino corpo (SPB) composto Sid4 è fuso Red Fluorescent Protein (Sid4-MRFP) 6 </sa&gt;. In cellule di lievito in crescita vegetativa centromeri sono sempre attaccato al SPB che è incorporato nel NM 7. SPB è identificato come una grande struttura rotonda nel NM. Per immagini prima e 20 minuti dopo l&#39;esaurimento della fonte di azoto possiamo determinare la distanza tra il cluster gene (GFP) e NM / SPB. Le distanze medie o mediana, prima e dopo l&#39;esaurimento di azoto vengono confrontati e possiamo quindi quantificare se c&#39;è uno spostamento nella localizzazione subcellulare del cluster gene dopo l&#39;esaurimento di azoto.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast at JoVE.com

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Il lievito di fissione,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, È un sistema ottimo modello per studiare i processi cellulari di base. Qui si descrive un metodo per eseguire l&#39;analisi quantitativa di cellule vive di lievito di fissione. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione del genoma all&#39;interno del nucleo cellulare, ma il metodo può essere utilizzato anche per studiare i fattori citosolici.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  University of Uppsala. Il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, È un sistema ottimo modello per studiare i processi cellulari di base. Qui si descrive un metodo per eseguire l'analisi quantitativa di cellule vive di lievito di fissione. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione del genoma all'interno del nucleo cellulare, ma il metodo può essere utilizzato anche per studiare i fattori citosolici.

Video: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Ricerca

Biologia

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...