La lesione da coltellata è un metodo di lesione meccanica che induce l'ablazione cellulare non specifica. Questo metodo facilita la valutazione della proliferazione e della differenziazione di RGC dopo lesione cerebrale. La lesione da coltellata mediata dall'ago è un metodo semplice ed efficiente per indurre lesioni cerebrali.
Questo metodo può essere applicato a molti campioni sperimentali utilizzando un set standard di strumenti. La capacità rigenerativa del pesce zebra è stata illustrata utilizzando il modello di lesione da coltellata. Nuove conoscenze sui meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione neuronale contribuiscono alla terapia rigenerativa nel sistema nervoso centrale.
Inizia posizionando un pesce zebra adulto anestetizzato o medaka su un vassoio di polistirolo. Fissare il pesce in posizione verticale tra due aghi calibro 30 inseriti verticalmente nel polistirolo. Tenere il corpo del pesce per impedire alla testa del pesce di muoversi, quindi inserire verticalmente un ago calibro 30 attraverso il cranio nella regione mediale di una delle sfere del tectum ottico.
Quindi, trasferire il pesce ferito in un acquario con acqua fresca dell'impianto di pesca. Una volta che i pesci si sono completamente ripresi dall'anestesia, spostare il serbatoio nel sistema di allevamento. Metti gli asciugamani di carta sul vassoio di polistirolo per posizionare il pesce anestetizzato.
Quindi tenere il corpo del pesce in posizione inserendo verticalmente due aghi calibro 30 su entrambi i lati della pinna anale. Una volta posizionato il pesce, fare un'incisione ventrale dall'ano al cuore. Mantenere il cuore visibile inserendo due aghi calibro 30 su ciascun lato.
Quindi utilizzare la punta della pinza per rimuovere lo strato epiteliale d'argento. Inserire l'ago di calibro 30 nel ventricolo, mantenendo la smussatura verso l'alto, e fare un'incisione nell'atrio usando la pinza. Quindi, spingere PBS nell'atrio premendo verso il basso sulla siringa per lavare il sangue dall'atrio.
Quando il sangue viene drenato e le branchie diventano bianche, interrompere la perfusione PBS. Successivamente, rimuovere gli aghi che fissano il corpo del pesce in posizione e fissare il lato ventrale del pesce verso il basso. Dopo aver tagliato il midollo spinale e rimosso il cranio dal tectum ottico e dal telencefalo, tagliare i nervi ottici e sezionare il cervello.
Successivamente, trasferire il cervello in tubi da 1,5 millilitri con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS, per fissare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato i cervelli fissi tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno, trasferire il cervello in tubi da 1,5 millilitri con un millilitro di saccarosio in peso del 30% in volume in PBS come crioprotettore e incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare il composto incorporato combinando il 30% di saccarosio con 30 millilitri di temperatura di taglio ottimale, o OCT, composto e conservare il composto a quattro gradi Celsius.
Per raffreddare il criomold una volta, incubare un blocco di alluminio durante la notte a meno 80 gradi Celsius e mettere il blocco pre-raffreddato in una scatola di polistirolo con un coperchio per prevenire il riscaldamento. Per le sezioni coronali, incorporare il cervello sezionato in un criomold regolando l'orientamento usando una pinza al microscopio. Quindi, posizionare il criomold sul blocco di alluminio pre-raffreddato nella scatola di polistirolo e lasciare che il composto OCT si congeli e diventi bianco.
Quando il composto si congela, applicare un piccolo cerchio di composto OCT su un disco campione prima di montare il crioblocco sul disco del campione. Posizionando il disco del campione nel criostato, congelare il composto OCT. Quindi posizionare il disco del campione sulla testa del campione nel criostato.
Dopo aver impostato l'orientamento del crioblocco, tagliare lo Strumento di personalizzazione di Office per rimuovere eventuali regioni aggiuntive. Tagliare sezioni seriali spesse 14 micrometri attraverso l'intero tectum ottico utilizzando un criostato e conservare i vetrini a meno 25 gradi Celsius. È stata valutata la proliferazione delle cellule gliali radiali, o RGC, nel tessuto cerebrale del pesce zebra.
La maggior parte delle RGC erano proliferanti negativi all'antigene cellulare nell'emisfero controlaterale illeso. A due giorni dall'infortunio, la proliferazione RGC è stata indotta sul lato leso del medaka tectum. Dopo la lesione cerebrale, la linea cellulare e la differenziazione RGC sono state valutate con bromodeossiuridina, o BrdU, marcatura.
L'analisi rappresentativa mostra neuroni appena nati a sette giorni dopo l'infortunio nel pesce zebra e medaka feriti. Uno dei passaggi critici nelle lesioni da coltellata è l'inserimento manuale dell'ago. Una lesione consistente è necessaria per creare risultati riproducibili.
I coloranti fluorescenti sono efficaci come marcatori di ferite. L'estensione della diffusione del colorante fluorescente indica la posizione e la profondità della ferita da taglio. Questa tecnica è potenzialmente adattata ad altre piccole specie di pesci e l'adattamento al medaka consente di confrontare la capacità rigenerativa.
